Wechselwirkungen von Proteinen mit den zytoplasmatischen Domänen der Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden aus einer HeLa-cDNA-Bibliothek mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid-Systems zwei Proteine identifiziert, die mit der zytoplasmatischen Domäne des 300 kDa Mannose-6-Phosphat-Rezeptors (MPR300-CT) interagieren. Für die Wechselwirkung zwischen Periplakin und dem MPR300-CT sind die N-terminalen 29 Aminosäuren der Rezeptordomäne, die das Tyrosin-haltige Internalisierungssignal umfassen, ausreichend und notwendig. Für die Bindung an den MPR300-CT sind die gesamte Linker- und Anteile der stabförmigen Rod-Domäne des Periplakins notwendig. Bei dem zweiten identifizierten Interaktionspartner handelt es sich um ein integrales, möglicherweise endosomales 93 kDa Protein, dessen Aminosäuresequenz keine Homologien zu bekannten humanen Proteinen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die strukturellen Voraussetzungen für die Wechselwirkung der zytoplasmatischen Domäne des MPR46 (MPR46-CT) mit den µ2- und µ3A-Untereinheiten der Adaptorkomplexe AP-2 und AP-3 im Hefe Two-Hybrid-System untersucht und durch Kopräzipitationsanalysen verifiziert. Die Wechselwirkung zwischen dem MPR46-CT und µ2 wird durch die C-terminalen Aminosäureste 49-64 der zytoplasmatischen Rezeptordomäne vermittelt, wobei der Tyrosin-haltige Internalisierungssignal und ein Cluster von sauren Aminosäuren innerhalb der Rest 49-63 eine kritische Bedeutung besitzen. Durch die Two-Hybrid-Analysen und Kopräzipitationsexperimente konnte erstmals die Interaktion zwischen dem MPR46-CT und µ3A nachgewiesen werden. Für die Interaktion zwischen dem MPR46-CT und µ3A sind das Di-Leucin-Motiv, das Tyrosin-haltige Internalisierungssignal sowie weitere, dazwischenliegenden Sequenzen der zytoplasmatischen MPR46-Domäne notwendig.