Ein Gen für ein neues Ubiquitin-konjugierendes Enzym: Genomische Organisation, Expression und Funktion

Abstract

Zu Beginn dieser Arbeit wurde die 3'untranslatierte Region der cDNA des HGC1- Gens, das im Rahmen der Diplomarbeit teilweise isoliert und charakterisiert worden war, über MARATHON-PCR vervollständigt. Die fehlenden Sequenzen im 5'Bereich der cDNA von HGC1 konnten wegen eines hohen GC-Gehalts in der 5'Region des Gens nicht identifiziert werden. Aus der bekannten Nukleotidsequenz von HGC1 (3194 bp) kann ein offener Leserahmen von 445 AS abgeleitet werden und eine 3'untranslatierte Region von 1858 bp für HGC1 bestimmt werden. Über Northern Blot Analysen mit Poly(A+) konnte außerdem zwei Transkripte von 2,4 kb (bekannt) und 4 kb nachgewiesen werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von HGC1 während der embryonalen und postnatalen Entwicklung der Maus zu analysieren. Dazu wurde das zu HGC1 homologe Gen der Maus (Mrhgc1) aus einer genomischen Phagenbibliothek des Mausstammes 129/SvJ isoliert und charakterisiert. Mrhgc1 erstreckt sich mit seinen 13 Exons über ca. 11 kb des Genoms der Maus. Die zusammengesetzte cDNA-Sequenz zeigt eine 95 %ige Homologie zu der Nukleotidsequenz von HGC1. Auf Proteinebene beträgt die Homologie 99 %. Mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierungen konnte Mrhgc1 auf dem Maus-Chromosom 3 in die Region F1 kartiert werden. Über Northern Blot Analysen konnte eine Expression von Mrhgc1 schon in embryonalen Stammzellen nachgewiesen werden. Abgleiche in der Datenbank ergaben, daß die abgeleitete Proteinsequenz von Mrhgc1 und HGC1 Homologien zu Mitgliedern der Genfamilie der 'ubiquitin conjugating enzymes' (E2-Enzyme) aufweist. Diese E2-Enzyme sind in den Ubiquitin-abhängigen Proteinabbau von regulatorischen und abnormalen Proteinen involviert. Sie zeichnen sich durch eine sogenannte UBC-Domäne aus, eine konservierte Region, dessen aktives Zentrum Ubiquitin bindet. Die Homologien von Mrhgc1 und HGC1 zu den E2-Enzymen beschränken sich auf die UBC-Domäne. Über Datenbankvergleiche konnte außerdem ein in Caenorhabditis elegans unbekanntes und zu HGC1 homologes Gen ('F25H2.8') identifiziert werden, das 44 % Homologie zu HGC1 zeigt. Über das Screening einer cDNA-Bibliothek von Drosophila melanogaster konnte eine cDNA (dmrhgc1) isoliert werden, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz eine 53 %ige Homologie zu der abgeleiteten Proteinsequenz von HGC1 aufweist. Ein homologes Gen in Saccharomyces cerevisiae konnte nicht ermittelt werden. Daraus kann geschlossen werden, daß HGC1 ein konserviertes Gen in vielzelligen Organismen (Metazoa) ist. Da sich die Homologie von HGC1 zu den E2-Enzymen auf die UBC-Domäne beschränkt, kann davon ausgegangen werden, daß HGC1 und dessen homologen Gene innerhalb der Genfamilie der 'ubiquitin conjugating enzymes' eine eigene Unterklasse bilden. Die Inaktivierung von Mrhgc1 mittels homologer Rekombination führte auf dem CD1-Hintergrund zu Null-Mutanten. Die homozygoten -/- Tiere zeigten in ihrem Phänotyp keine Auffälligkeiten in Bezug auf Köpergröße, - gewicht oder Verhalten und waren fertil. Auf dem 129/SvJ-Hintergrund war eine reduzierte Zahl an homozygoten -/- Tieren zu beobachten, die mit 13,8 % wesentlich unter dem zu erwarteten Viertel nach den Mendelschen Regeln liegt. Wurden tragende Muttertiere am 18,5. Tag der Schwangerschaft getötet, die Embryonen präpariert und genotypisiert, so konnte ein Anteil von 25 % an -/- Tieren unter den Embryonen bestimmt werden. Die homozygoten -/- Tiere zeigten keine Auffälligkeiten und waren fertil. Wurde cerhgc1 in C. elgans mittels RNAi inaktiviert, zeigten die -/- Tiere der F1-Generation bis zum Hermaphroditenstadium keine Auffälligkeiten. Mit Beginn der Eiablage kam es bei diesen Tieren zu Lähmungserscheinungen und zu frühzeitigem Tod (Paralyse). In transgenen Tiere konnte eine Expression von cerhgc1 in den Nervenzellen und allen Muskelzellen, besonders im Pharynxmusklel, detektiert werden und zwar mit Beginn des 300 Zellstadiums der Embryonen. Der in C. elegans auftretende Phänotyp (Lähmungserscheinungen) läßt sich durch eine Störung in der Reizleitung von Nervenzellen zu Muskelzellen erklären. Unc-2-Mutanten, die einen Defekt in einer Untereinheit von Calciumkanälen haben, zeigen ebenfalls derartige Lähmungserscheinungen. Über 'whole mount' in situ Hybridisierungen an Drosophila Embryonen konnte eine Expression von dmrhgc1 im sich entwickelnden Nervensystem und in Embryonen später Stadien (Stadium 17) in Gehirn und Nervensystem nachgewiesen werden.