Protein NMR studies of two systems involved in bacterial pathogenicity

Abstract

Die vorliegende Dissertation beinhaltet neue Strukturdaten über bakterielle Proteine, die an der Transkriptionsregulation und Proteinsekretion beteiligt sind, sowie einen Beitrag zur Verbesserung der Strukturaufklärung von homodimeren Proteinen mittels NMR-Spektroskopie. Ein Hauptaugenmerk liegt auf der Untersuchung von zwei homodimeren bakteriellen Proteinen: Dem Transkriptionsfaktor CylR2 aus Enterococcus faecalis und dem Chaperon CesT aus enteropathogenem Escherichia coli. Enterococcus faecalis hat sich zu einer Hauptursache von Infektionen in Krankenhäusern aufgrund von Antibiotikaresistenzen entwickelt, wobei die schwere der Infektion mit einem von Enterococcus faecalis sekretierten Protein, dem Cytolysin, zusammenhängt. Die Produktion dieses Cytolysins wird von einem zwei-Komponenten CylR1/CylR2 System über einen autoinduzierten Quorum-Sensing Mechanismus reguliert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass das regulatorische Protein CylR2 ein rigides Dimer formt. Die Kristall- und NMR-Struktur sind im wesentlichen identisch. Jedes Monomer besteht aus einem fünf Helix-Bündel, das ein Helix-Turn-Helix DNA-Bindingsmotiv enthält und durch ein zweisträngiges antiparalleles beta-Faltblatt verlängert ist. Die Lösung der NMR-Struktur erfolgt mit Hilfe einer neuartigen Strukturbestimmungsmethode für homodimere Proteine. Um die beiden Untereinheiten als rigide Körper aneinander zu docken, werden experimentelle residuale dipolaren Kopplungen der Rückgrat-Amide und intermolekulare, langreichweitige Distanzen, die über paramagnetische Relaxationsverstärkung ermittelt werden, verwendet. Eine Modellstruktur für CylR2 im Komplex mit seiner spezifischen palindromischen DNA innerhalb des Cytolysinpromotors wird basierend auf der Veränderung der chemischen Verschiebungen von CylR2 bei DNA-Bindung erstellt. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von CylR2 als Repressor der Cytolysintranskription hin. Enteropathogenes Escherichia coli ist eine Hauptursache von Durchfallerkrankungen, die durch Sekretion bakterieller Proteine über ein Type III Sekretionssystem in die menschliche Wirtszelle ausgelöst werden. CesT ist an dem Sekretionsmechanismus beteiligt indem es Effektorproteine vor der Sekretion spezifisch im bakteriellen Cytoplasma bindet und dadurch den Effektor in einem sekretionsbereiten Zustand hält. Die genaue Funktion des Chaperons und damit der Mechanismus der bakteriellen Type III Proteinsekretion ist noch ungeklärt. Mittels dipolarer Kopplungen wird gezeigt, dass CesT in Lösung, anders als im Kristall, eine den homologen Proteinen ähnliche Struktur ausbildet. Viele hydrophobe Interaktionen werden für die Erkennung von Effektoren durch CesT als wichtig identifiziert und abschliessend wird ein Modell für die Erkennung des Chaperon/Effektor Komplexes durch das Type III Sekretionssystem vorgeschlagen.