NMR structural studies on the periplasmic domain of CitA and DcuS.

Abstract

Zwei-Komponenten regulatorische Systeme sind die häufigsten Systeme für transmembrane Signaltransduktion in Bakterien und spielen eine Hauptrolle bei der zellulären Adaptation an die Bedingungen der Umwelt und Stress. Sie bestehen aus zwei verschiedenen Proteinen, einer sensorischen Histidinkinase, die normalerweise in der Membran lokalisiert ist, und einem verwandten Antwortregulator im Cytoplasma. Für diese Systeme gibt es eine Fülle von molekularbiologischen Studien. Trotzdem sind keine Strukturinformationen über die transmembrane Signaltransduktion vorhanden. Das Ziel dieser Untersuchung war es, Informationen über die Struktur und Dynamik der Signalerkennung und -transduktion von der periplasmatischen sensorischen Domäne über den membranständigen zwei-Komponenten Sensor in die cytoplasmatische Domäne zu erhalten. In dieser Arbeit werden Strukturuntersuchungen mittels NMR an der periplasmatischen Domäne von zwei Histidinkinasen präsentiert. DcuS und CitA sind bakterielle Sensorhistidinkinasen, die eine transmembrane Domäne besitzen. Sie sind Teil eines zwei-Komponenten Signaltransduktionssystems, das den Transport und Metabolismus von Di- und Tri-Carboxylaten in Abhängigkeit ihrer Konzentration in der Umgebung regulieren. Ihre periplasmitischen Domänen (DcuS-PD und CitAP) sind homolog, haben eine PAS-Domäne und eine Bindungsstelle für die Carboxylate. CitA fungiert als ein hochspezifischer Citratrezeptor während DcuS von einer Reihe von C4-Dicarboxylaten wie Fumarat und Succinat stimuliert wird. Als ein erster Schritt in Hinblick auf die Aufklärung des Signaltransduktionsprozesses wurde die Lösungs-NMR-Struktur der periplasmatischen Domäne von DcuS gelöst. Die Struktur wurde mit residualen dipolaren Kopplungen (RDCs), die über eine neuartige Strategie zur simultanen Messung von RDCs mit minimalem Resonanzüberlap gemessen wurden, verfeinert. Die Bindungstasche von DcuS-PD für einige C4 Di-Carboxylate wurde mittels 15N-1H HSQC basierter Titrationen definiert. Der Einfluss der Ligandenbindung an DcuS-PD war schwach.Weder Veränderungen der chemischen Verschiebungen noch Anstieg der Signalintensitäten für Reste außerhalb der Bindungstasche wurden beobachtet. Deshalb blieb der Mechanismus der Signalransduktion ungewiss. Lösungs-NMR-Strukturen von CitAP konnten aufgrund starker Linienverbreiterung, die in den NMR-Spektren beobachtet wurde, nicht gelöst werden. Konformationeller Austausch war der Hauptgrund der Linienverbreiterung. Die Kristallstrukturen der citrat-freien und gebundenen Form von CitAP konnten aufgeklärt werden. Hauptunterschiede wurden in der Citratbindungsregion und in der C-terminalen Region des Proteins beobachtet. Zusätzlich veränderten sich die chemischen Verschiebungen und die HetNOE-Werte in diesen Teilen des Proteins stark. In der citrat-gebundenen Struktur wurde ein Na+-Ion zwischen die Nterminale Helix und die beta-Faltblätter gesetzt. Das wurde auch durch NMR-Titrationen bestätigt. Damit könnte CitAP in Lösung sowohl an der Erkennung von Citrat als auch von Na+ beteiligt sein. Überraschenderweise passen die für cirtatfreies CitAP gemessenen RDCs besser zu der citratgebundenen Struktur von CitAP. Das deutet darauf hin, dass in Lösung eine vorgeformte Bindungstasche von CitAP vorliegt. Nichtsdestotrotz ermöglichten die spezifische strukturellen Unterschiede zwischen der citratfreien und den -gebundenen Strukturen den Vorschlag eines Modells für den Mechanismus der Signaltransduktion. Dieses Modell passt zu den verfügbaren NMR-Daten und ist auch ähnlich zu dem für Aspartatsensoren beschriebenen Mechanismus der Signaltransduktion.