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NMR investigations of 15.5K associated protein-RNA complexes

dc.contributor.advisorCarlomagno, Teresa PD Dr.de
dc.contributor.authorLi, Pingde
dc.date.accessioned2008-01-28T15:08:00Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T10:40:32Zde
dc.date.available2013-01-30T23:51:25Zde
dc.date.issued2008-01-28de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACA8-9de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-2216
dc.description.abstractDas Spleißosom besteht aus unterschiedlichen snRNPs, die eine Spleißreaktion katalysieren. Um das Spleißosom zu aktivieren und den ersten Schritt der Spleißreaktion zu ermöglichen, dissoziieren die basengepaarten U4 und U6 snRNAs des U4/U6 snRNP Komplexes. Dieser Komplex ist mit den spleißosomalen gemeinsamen Sm- und LSm-Proteinen, sowie mit den spezifischen Proteinen 15.5K, hPrp31 und dem CypH/hPrp4/hPrp3 Protein-Trikomplex assoziiert. Um die strukturellen Umlagerungen, innerhalb des U4/U6 snRNA-Duplexes, die der Spleißreaktion vorangehen, zu verstehen, ist das Wissen über diese Proteine und ihre Wechselwirkungen von immenser Wichtigkeit. Insbesondere deshalb da konformationelle Änderungen der snRNAs von den gebundenen Proteinen stabilisiert und unterst\"utzt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktionen von zwei der spezifisch bindenden Proteine, dem 15.5K und hPrp31, des U4 snRNP Komplexes zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung zweidimensionaler NMR- Titrationsexperimente (HSQCs) sowie Kreuz-Sättigungsexperimenten an den Komplexen hPrp31-15.5K-U4 5"-SL und hPrp3178-333-15.5K-U4 5"-SL die Bindungsoberfläche des 15.5K zum hPrp31 untersucht. Durch Kombination von Homologie-Modulierung und dem HADDOCK2.0 Docking wurde mit Hilfe von NMR und biochemischen Daten ein 3D Model des ternären Komplexes entwickelt. Aus diesen Ergebnissen charakterisieren wir die Nop-Domäne als bona fide RNP Bindedomäne. Die Rolle des 15.5K Proteins ist daher nicht auf das Induzieren und Stabilisieren einer hPrp31 Bindungsstelle in der RNA beschränkt, sondern es stellt selber etwa die Hälfte der Kontaktoberfläche der Nop-Domäne dar. Mit unserem Andockmodel waren wir in der Lage aufzuzeigen, dass eine Verlängerung des Stamms II der U4 snRNA aufgrund einer physikalischen Barriere, welche die Nop-Domäne bereitstellt, benachteiligt wird. Da in box C/D snoRNAs der Stamm II die ideale Länge überschreitet, kann hPrp31 nicht in box C/D snoRNP Komplexen gebunden werden. Bei einer Oberflächenmutante von 15.5K, die Mutationen außerhalb der Bindungsoberfläche zwischen 15.5K und hPrp31 besitzt, wurde zuvor gezeigt, dass die Bindung von hPrp31 stark reduziert wird. Unter Verwendung von HSQC-Titrationsexperimenten und Verfeinerungen der Struktur mit Hilfe residualer dipolarer Kopplungen konnten wir demonstrieren, dass die Struktur der Mutante nicht wesentlich vom Wildtyp abweicht und die niedrigere Bindungsaffinität daher von kleinen Änderungen im Ladungsverhalten der Bindeoberfläche hervorgerufen werden könnte. Weiterhin wurden strukturelle Änderungen des 15.5K Proteins im Komplex mit verschiedenen box C/D snoRNA Konstrukten mittels Titrationsexperimenten untersucht, um die Frage zu klären, ob die Struktur von 15.5K auch zur Selektivität der primären RNPs beiträgt. Die Daten der chemischen Verschiebungsabweichungen deuten daraufhin, dass die Struktur von 15.5K sich nicht wesentlich in den primären RNP Komplexen unterscheidet. Die Selektivität wird daher auf die Unterschiede der RNAs und der sekundären Bindeproteine zurückzuführen sein.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleNMR investigations of 15.5K associated protein-RNA complexesde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedNMR Untersuchungen von 15.5K Protein assoziierten Protein-RNA Komplexende
dc.contributor.refereeDiederichsen, Ulf Prof. Dr.de
dc.date.examination2007-10-30de
dc.subject.dnb540 Chemiede
dc.description.abstractengThe spliceosome, consisting of different snRNPs and numerous non-U snRNP factors, catalyzes the splicing reaction. To activate the spliceosome and enable the first step of splicing to begin, the extensively base-paired U4, U6 snRNAs in the U4/U6 snRNP dissociate from each other. The U4, U6 snRNAs are associated to the common core proteins of the spliceosome namely the Sm and LSm proteins, as well as the specific proteins including 15.5K, hPrp31, and the CypH/hPrp4/hPrp3 protein tri-complex. The knowledge on these proteins is of paramount importance for the understanding of the dramatic structural rearrangement of the U4/U6 snRNA duplex prior to splicing. In this work, effort was made to understand the interactions between two of these specific proteins namely 15.5K and hPrp31 in the context of the U4 snRNP. Using HSQC titrations and cross-saturation experiments on the hPrp31-15.5K-U4 5"-SL and hPrp3178-333 -15.5K-U4 5"-SL complexes, we defined the interaction surface on 15.5K in complex with hPrp31. Combining the NMR and biochemical data, we successfully generated a 3D model of the ternary complex using comparative modelling and the HADDOCK2.0 docking program. From these results, we characterized the Nop domain as a bona fide RNP binding domain. The role of the assembly-initiating 15.5K is, therefore, not restricted to inducing or stabilizing a hPrp31 binding site in the RNA; rather 15.5K itself provides approximately half of the contact surface for the Nop domain of hPrp31. In the docking model, the interaction surfaces on 15.5K and hPrp31 showed charge complement. From our docking model we could also demonstrate that the elongation of stem II in U4 snRNA is highly unfavourable due to the physical barrier provided by the Nop domain. As in box C/D snoRNAs the length of the stem II naturally exceeds the required length, hPrp31 is not recruited into the box C/D snoRNPs. A surface mutant of 15.5K, which contains mutations outside the interaction surface between 15.5K and hPrp31, was previously shown to strongly reduce the binding of hPrp31. Using HSQC titration and RDC refinement, we could demonstrate that the structure of this mutant does not significantly vary from the wild type and therefore, the effect of this 15.5K mutant on hPrp31 binding could arise from subtle changes in the charge property of the interaction surface. Furthermore, the structural changes of 15.5K in complexes with different box C/D snoRNA constructs were studied using HSQC titrations to address the question whether the structure of 15.5K also contributes to the selectivity of these primary RNPs. The chemical shift perturbation data showed that the structure of 15.5K does not differ dramatically in this primary RNPs. Therefore, the selectivity arises primarily from the differences in the RNAs and the secondary binding proteins.de
dc.contributor.coRefereeGriesinger, Christian Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeCarlomagno, Teresa PD Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.ger15.5K Proteinde
dc.subject.gerNop Domänede
dc.subject.gerhPrp31de
dc.subject.eng15.5K proteinde
dc.subject.engNop domainde
dc.subject.enghPrp31de
dc.subject.bk35.25 Spektrochemische Analysede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1686-9de
dc.identifier.purlwebdoc-1686de
dc.affiliation.instituteFakultät für Chemiede
dc.subject.gokfullSXC 000 Struktur von Biomolekülende
dc.identifier.ppn59110489Xde


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