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dc.contributor.advisor Terlau, Heinrich PD Dr. de
dc.contributor.author Finol Urdaneta, Rocio Karin de
dc.date.accessioned 2004-05-28T15:08:14Z de
dc.date.accessioned 2013-01-18T10:32:39Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:51:22Z de
dc.date.issued 2004-05-28 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACC2-D de
dc.description.abstract Ionenkanäle sind spezialisierte Membranproteine, die im geöffneten Zustand Ionen mit einer hohen Rate durch die Membran passieren lassen. Spannungsabhängige K+-Kanäle gehören zu einer heterogenen Gruppe von Proteinen, die dafür bekannt sind, die synaptische Übertragung und die Sekretion endokriner Zellen wie z.B. die Freisetzung von Insulin durch die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse zu modulieren. Bei der elektrischen Erregung von z.B. Herzmuskelzellen spielen Kalium-Ströme eine wichtige Rolle. So sind K-Ströme neben der Stabilisierung des Ruhepotentials grundlegend an der Modulation der zellulären Erregbarkeit und der Regulation der Membranrepolarisierung beteiligt. Darüber hinaus ist bekannt, dass Fehlfunktionen von K-Kanälen zu einer Vielzahl von Krankheitsbildern führen kann. Somit haben K-Kanäle eine wichtige Funktion auf der zellulären Ebene und es besteht ein großes Interesse an dem Studium dieser Kanäle.In der vorliegenden Arbeit wurden die murinen und humanen Orthologe des Kv1.7 Kanals (Gen kcna7 bzw. Gen KCNA7) mittels PCR und PCR verwandter Techniken kloniert. Es war bekannt, daß Transkripte der Gene kcna7/KCNA7 in verschiedenen Geweben vorhanden sind, wobei eine starken Expression im Herz und im Skelettmuskel gefunden wurde (Kalman et al., 1998; Kashuba et al., 2001). Für das Maus-Gen sind zwei mögliche Startpunkte der Translationsstellen identifiziert worden, die eine funktionelle Wichtigkeit zu haben scheinen. Daher wurden zwei Konstrukte hergestellt, eines mit dem längsten gefundenen offenen Leserahmen - mKv1.7 Wildtyp (mKv1.7 wt) - und ein zweiter Klon -mKv1.7-T0, welches ein 32 Aminosäuren kürzeres Protein darstellt, dass durch die Initiation am zweiten AUG entsteht. In der humanen Sequenz findet man nur eine Initiationsstelle, die der zweiten AUG Stelle in der Maus entspricht. Dieses Konstrukt hKV1.7 ist homolog zu mKv1.7-T0. Die Analyse der Gensequenz von kcna7/KCNA7 deutet auf mehrere interessante Aspekte hin, die eine hochgradig kontrollierte Transkription und mögliche posttranskriptionale Modifikation einschließen. Die Daten, die in dieser Arbeit erhoben wurden, unterscheiden sich in verschieden Aspekten zu früher berichten Befunden im Hinblick auf die Maus Kv1.7 Kanäle. Der Hauptunterschied lag in einer Punktmutation in der DNA-Sequenz, die zu einem Proteinprodukt mit einem veränderten aminoterminalen Ende führte.Bis heute ist wenig über die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des murinen Kanals bekannt und einige Daten widersprechen einander. Darüber hinaus ist für den humanen Kv1.7 Kanal keine biophysikalische oder pharmakologische Information verfügbar. Um die Ursache für die Unterschiede in unseren Ergebnissen und den veröffentlichten Daten zu finden, wurde ein Äquivalent zu dem von Bardien et al. in 2002 beschriebenen Maus Kv1.7 Konstrukt parallel zu mKv1.7 wt charakterisiert. Unsere Ergebnisse stellen die ersten biophysikalischen und pharmakologischen Charakterisierungen des humanen Kv1.7 Kanals dar.Die elektrophysiologische Charakterisierung des murinen und humanen Kv1.7 Kanals wurde im heterologen Xenopus laevis Expressionssystem mittels Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Messungen und der Patch-Clamp Technik durchgeführt. Kv1.7 Kanäle aktivieren zwischen -4 und +4 mV mit einer relativ schnellen Aktivierungkinetik. Interessanterweise inaktiviert der Wildtyp Kv1.7 Kanal aus der Maus ungefähr dreimal schneller als mKv1.7-T0 und hKv1.7. Die schnellere Inaktivierungskinetik von mKv1.7 wt steht in Zusammenhang mit den 32 Aminosäuren im N-Terminus, die bei mKv1.7-T0 und hKv1.7 fehlen. Die N-terminalen Aminosäuren des mKV1.7 Wildtyp Kanals beinhalten eine hydrophobe und eine positiv geladenen Sequenz, wie sie für Inaktivierungsproteine anderer Kv Kanäle einschließlich Shaker beschrieben werden. Allerdings ist die schnelle Komponente der Inaktivierung des mKv1.7 wt hauptsächlich durch die N-Typ Inaktivierung bedingt, die durch ansteigende Konzentrationen von (K+)o moduliert werden kann. Kv1.7 Kanäle unterliegen einer kumulativen Inaktivierung, die gegenüber der extrazelluläre Kaliumkonzentration (K+)o sensitiv ist.Das pharmakologische Profil des murinen und des menschlichen Kv1.7 Kanals schließt die Sensitivität zu extrazellulär applizierten TEA und Zn2+ im niedrigen millimolaren Bereich ein. Kv1.7 Kanäle werden durch die Conotoxine kM-RIIIK und Conkunitzin-S mit Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich blockiert. Somit konnten die Kv1.7 Kanäle als Zielmoleküle für diese neue Familie von Conustoxinen identifiziert werden. Darüber hinaus war mKv1.7 sensitiv gegenüber Veränderungen des Redoxzustandes, was sich durch einen Abfall der Stromamplitude und einer substantiellen Steigerung in der Inaktivierungsrate unter oxidativen Bedingungen zeigte.Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen die funktionellen Eigenschaften der spannungsaktivierten K+-Kanäle mKv1.7 und hKv1.7, die aus Skelett- und Herzmuskel von Maus und Mensch mittels reverser Transkrition und der Polymerase Kettenreaktion amplifiziert worden sind. Das Expressionsprofil, die Promotoranalyse und die Redoxmodulation der Kinetiken des Kv1.7 Kanals weisen darauf hin, daß diese Kanäle ein möglicher molekularer Bestandteil der Hypoxie-induzierten Membrandepolarisierung in Muskelzellen sind. Zur Beantwortung der offenen Fragen bezüglich der physiologischen Bedeutung des Kv1.7 Kanals sind weitere Untersuchungen erforderlich. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm de
dc.title Investigation of the heterologous expression of the voltage activated potassium channel Kv1.7 de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Untersuchung der heterologen Expression des spannungsabhaengigen Kalium-Kanals Kv1.7 de
dc.contributor.referee Schuermann, Friedrich-Wilhelm Prof. Dr. de
dc.date.examination 2004-04-29 de
dc.description.abstracteng Ion channels are specialized membrane proteins that let ions pass through at a high rate when they are in the open conformation. Voltage gated K+ channels are a heterogeneous group of proteins known to modulate synaptic transmission and secretion from endocrine cells, such as insulin from pancreatic islet cells. As an example, K+ currents (IK+) play critical roles in determining cardiac electrical activities. Besides stabilizing resting potential, IK+ in cardiac cells also plays an important role in modulating cellular excitability and regulating membrane repolarization. Moreover, dysfunction of Kv channels is associated to multiple pathophysiological conditions. Hence, K+ channels have important functions at the cellular level and much interest has been focused on the study of ion channels.In the present study the murine and human orthologs of the Kv1.7 channels (kcna7 and KCNA7 genes, respectively) have been cloned using PCR and PCR related techniques. Transcripts of the kcna7/KCNA7 genes are reported to be present in several tissues including strong expression in the heart and skeletal muscle (Kalman et al., 1998; Kashuba et al., 2001). For the mouse gene two potential initiation of the translation sites have been identified which might be of functional importance. Therefore two constructs were generated one with the longest resulting open reading frame named mKv1.7 wild type (mKv1.7 wt) and a second clone called mKv1.7-T0 with a product 32 amino acid shorter as a result of the initiation at the second AUG. The human sequence only presented one initiation site corresponding to the second AUG identified in the mouse resulting in a construct, hKv1.7, homologous to Kv1.7-T0. The analysis of the sequence of the kcna7/KCNA7 genes suggests several interesting aspects that include highly controlled transcription and possibly postrancriptional modifications. The data gathered in this work differed in various aspects to what was previously reported about the mouse Kv1.7 channels. The main differences were due to single nucleotide changes in the DNA sequences that led to protein products with different amino termini.To date only little is known about the biophysical and pharmacological characteristics of the murine Kv1.7 channels and some data are even controversial. In addition there is no biophysical or pharmacological information available on the human ortholog channel. In order to identify the source of the differences observed between our results and the published data, a mouse Kv1.7 construct equivalent to the clone reported by Bardien et al. in 2002 (mKv1.7-T0) was characterized in parallel to mKv1.7 wt channels. Our results include the first biophysical and pharmacological characterization of the human Kv1.7 channel.The electrophysiological characterization of the mouse and human Kv1.7 channels was performed using two electrodes voltage clamp and patch clamp techniques by using the Xenopus laevis oocyte heterologous expression system. Kv1.7 channels activate between -4 and +4mV with relatively fast activation kinetics. Interestingly, the wild type mouse channels inactivate about 3fold faster than mKv1.7-T0 and expectedly the hKv1.7. The faster inactivation kinetics of mKv1.7 wt channels is positively correlated to the presence of 32 amino acids in the N-terminus that are absent in the mKv1.7-T0 and hKv1.7. The N-terminal 32aa from mKv1.7 wt channels include a hydrophobic and a positively charged region as reported for the inactivation peptides described for other Kv channels including Shaker. Thus the fast component of the inactivation of mKv1.7 wt is predominantly due to N-type inactivation that can be modulated by increasing concentrations of [K+]o. Kv1.7 channels undergo cumulative inactivation that is also sensitive to [K+]o.The pharmacological profile of the mouse and human Kv1.7 channels includes sensitivity to extracellularly applied TEA and Zn2+ in the low millimolar range. Kv1.7 channels are blocked by the conotoxins kM-RIIIK and Conkunitzin-S with affinities in the low nanomolar range, identifying Kv1.7 channels as a target for these new families of conus peptides. Furthermore, mKv17 wt was sensitive to redox modulation with a concomitant decrease in the current amplitude and a substantial enhancement of the inactivation rate under oxidative conditions.The findings of the present study demonstrate the functional properties of the mammalian voltage activated K+ channels mKv1.7 and hKv1.7 amplified from skeletal and cardiac muscle from mouse and human by means of reverse transcription and polymerase chain reaction. The expression profile, putative promoter analysis and redox modulation of the kinetics of Kv1.7 channels suggested that this channels might be a potential molecular component of hypoxia-induced membrane depolarization responses in muscle cells. Therefore, many interesting open questions on the physiological role of Kv1.7 channels await further investigation. de
dc.contributor.coReferee Hoerner, Michael Prof. Dr. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger Kallium-Kanal de
dc.subject.ger Kv1.7 de
dc.subject.ger heterologen Expression de
dc.subject.ger Pharmakologie de
dc.subject.ger 540 Chemie de
dc.subject.eng potassium channels de
dc.subject.eng Kv1.7 de
dc.subject.eng heterologous expression de
dc.subject.eng pharmacology de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-207-5 de
dc.identifier.purl webdoc-207 de
dc.affiliation.institute Fakultät für Chemie de
dc.identifier.ppn 471048267 de

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