Investigation of the heterologous expression of the voltage activated potassium channel Kv1.7

Abstract

Ionenkanäle sind spezialisierte Membranproteine, die im geöffneten Zustand Ionen mit einer hohen Rate durch die Membran passieren lassen. Spannungsabhängige K+-Kanäle gehören zu einer heterogenen Gruppe von Proteinen, die dafür bekannt sind, die synaptische Übertragung und die Sekretion endokriner Zellen wie z.B. die Freisetzung von Insulin durch die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse zu modulieren. Bei der elektrischen Erregung von z.B. Herzmuskelzellen spielen Kalium-Ströme eine wichtige Rolle. So sind K-Ströme neben der Stabilisierung des Ruhepotentials grundlegend an der Modulation der zellulären Erregbarkeit und der Regulation der Membranrepolarisierung beteiligt. Darüber hinaus ist bekannt, dass Fehlfunktionen von K-Kanälen zu einer Vielzahl von Krankheitsbildern führen kann. Somit haben K-Kanäle eine wichtige Funktion auf der zellulären Ebene und es besteht ein großes Interesse an dem Studium dieser Kanäle.In der vorliegenden Arbeit wurden die murinen und humanen Orthologe des Kv1.7 Kanals (Gen kcna7 bzw. Gen KCNA7) mittels PCR und PCR verwandter Techniken kloniert. Es war bekannt, daß Transkripte der Gene kcna7/KCNA7 in verschiedenen Geweben vorhanden sind, wobei eine starken Expression im Herz und im Skelettmuskel gefunden wurde (Kalman et al., 1998; Kashuba et al., 2001). Für das Maus-Gen sind zwei mögliche Startpunkte der Translationsstellen identifiziert worden, die eine funktionelle Wichtigkeit zu haben scheinen. Daher wurden zwei Konstrukte hergestellt, eines mit dem längsten gefundenen offenen Leserahmen - mKv1.7 Wildtyp (mKv1.7 wt) - und ein zweiter Klon -mKv1.7-T0, welches ein 32 Aminosäuren kürzeres Protein darstellt, dass durch die Initiation am zweiten AUG entsteht. In der humanen Sequenz findet man nur eine Initiationsstelle, die der zweiten AUG Stelle in der Maus entspricht. Dieses Konstrukt hKV1.7 ist homolog zu mKv1.7-T0. Die Analyse der Gensequenz von kcna7/KCNA7 deutet auf mehrere interessante Aspekte hin, die eine hochgradig kontrollierte Transkription und mögliche posttranskriptionale Modifikation einschließen. Die Daten, die in dieser Arbeit erhoben wurden, unterscheiden sich in verschieden Aspekten zu früher berichten Befunden im Hinblick auf die Maus Kv1.7 Kanäle. Der Hauptunterschied lag in einer Punktmutation in der DNA-Sequenz, die zu einem Proteinprodukt mit einem veränderten aminoterminalen Ende führte.Bis heute ist wenig über die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des murinen Kanals bekannt und einige Daten widersprechen einander. Darüber hinaus ist für den humanen Kv1.7 Kanal keine biophysikalische oder pharmakologische Information verfügbar. Um die Ursache für die Unterschiede in unseren Ergebnissen und den veröffentlichten Daten zu finden, wurde ein Äquivalent zu dem von Bardien et al. in 2002 beschriebenen Maus Kv1.7 Konstrukt parallel zu mKv1.7 wt charakterisiert. Unsere Ergebnisse stellen die ersten biophysikalischen und pharmakologischen Charakterisierungen des humanen Kv1.7 Kanals dar.Die elektrophysiologische Charakterisierung des murinen und humanen Kv1.7 Kanals wurde im heterologen Xenopus laevis Expressionssystem mittels Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Messungen und der Patch-Clamp Technik durchgeführt. Kv1.7 Kanäle aktivieren zwischen -4 und +4 mV mit einer relativ schnellen Aktivierungkinetik. Interessanterweise inaktiviert der Wildtyp Kv1.7 Kanal aus der Maus ungefähr dreimal schneller als mKv1.7-T0 und hKv1.7. Die schnellere Inaktivierungskinetik von mKv1.7 wt steht in Zusammenhang mit den 32 Aminosäuren im N-Terminus, die bei mKv1.7-T0 und hKv1.7 fehlen. Die N-terminalen Aminosäuren des mKV1.7 Wildtyp Kanals beinhalten eine hydrophobe und eine positiv geladenen Sequenz, wie sie für Inaktivierungsproteine anderer Kv Kanäle einschließlich Shaker beschrieben werden. Allerdings ist die schnelle Komponente der Inaktivierung des mKv1.7 wt hauptsächlich durch die N-Typ Inaktivierung bedingt, die durch ansteigende Konzentrationen von (K+)o moduliert werden kann. Kv1.7 Kanäle unterliegen einer kumulativen Inaktivierung, die gegenüber der extrazelluläre Kaliumkonzentration (K+)o sensitiv ist.Das pharmakologische Profil des murinen und des menschlichen Kv1.7 Kanals schließt die Sensitivität zu extrazellulär applizierten TEA und Zn2+ im niedrigen millimolaren Bereich ein. Kv1.7 Kanäle werden durch die Conotoxine kM-RIIIK und Conkunitzin-S mit Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich blockiert. Somit konnten die Kv1.7 Kanäle als Zielmoleküle für diese neue Familie von Conustoxinen identifiziert werden. Darüber hinaus war mKv1.7 sensitiv gegenüber Veränderungen des Redoxzustandes, was sich durch einen Abfall der Stromamplitude und einer substantiellen Steigerung in der Inaktivierungsrate unter oxidativen Bedingungen zeigte.Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen die funktionellen Eigenschaften der spannungsaktivierten K+-Kanäle mKv1.7 und hKv1.7, die aus Skelett- und Herzmuskel von Maus und Mensch mittels reverser Transkrition und der Polymerase Kettenreaktion amplifiziert worden sind. Das Expressionsprofil, die Promotoranalyse und die Redoxmodulation der Kinetiken des Kv1.7 Kanals weisen darauf hin, daß diese Kanäle ein möglicher molekularer Bestandteil der Hypoxie-induzierten Membrandepolarisierung in Muskelzellen sind. Zur Beantwortung der offenen Fragen bezüglich der physiologischen Bedeutung des Kv1.7 Kanals sind weitere Untersuchungen erforderlich.