Synthese und Untersuchung von Alanyl-PNA Oligomeren und deren Einfluß auf β-Faltblatt Strukturen

Abstract

Die Funktion und Aktivität von Proteinen hängt im wesentlichem von der dreidimensionalen Struktur und der Konformation des Proteins ab. Die Konformationswechsel sowie die Wechselwirkung zwischen Proteinen, beeinflusst durch einen molekularen Schalter, würden maßgeblich zur biologischen Aktivitätsänderung und sowie deren Funktion beitragen. Die als Schalter verwendeten Alanyl-PNA Oligomere sind Oligopeptide mit alternierender Konfiguration und mit Nucleobasen, die an der β-Position der Alanyl-Aminosäure kovalent gebunden sind.Im Rahmen dieser Arbeit wurden Interaktionen und damit die Stabilität von verschiedenen komplementärer Alanyl-PNA Oligomere mit Hinblick auf eine mögliche Schalter -Funktion mittels UV- und NMR-spektroskopie untersucht. Die untersuchten Alanyl-PNA Oligomere unterschieden sich in den Längen und durch die eingebauten Fehlstellen. Weiterhin wurden verschiedene Puffersysteme für die Untersuchungn gewählt. Ein zweiter Punkt dieser Arbeit war der Einbau eines Alanyl-PNA Stranges in ein Peptid oder Protein. Durch Zugabe eines komplementären Alanyl-PNA-Gegenstranges sollte sich ein β-Faltblatt stabilisieren lassen. Weiterhin wurde nach einer effizienten Methode gesucht, um N-methylierte Aminosäurederivate ausgehend von N-Methyl-Serinlacton 42 zu entwickeln und diese in alanyl-PNA Oligomere einbauen zu können. Durch das Ersetzen der C-Terminalen Helix des humanen Interleukin 8 (hIL-8) (Aminosäure 56-77) durch ein alanyl-PNA Hexamer wollten wir eine Schaltung des helicalen C-Terminus zu einer anderen stabilen Konformation erreichen. Der Einbau von alanyl-PNA Oligomere in Peptide und Proteine erweißt sich als schwierig, so dass wir am Ende dieser Arbeit in Kooperation mit dem Arbeitskreis Bordusa eine enzymatische Ligation zum Einbau durchgeführt haben.Der Erste Teil dieser Arbeit, wurden verschiedene Alanyl-PNA Oligomere unterschiedlicher Länge dargestellt, wobei um Aggregationen zu vermeiden auch die nicht komplementäre Nucleoaminosäure Boc-AlaT-OH, sowie die Aminosäuren Lysin und Glutaminsäure eingebaut wurden. Anhand dieser Sequenzen wurden neben der temperaturabhängigen UV Spektroskopie in Kooperation mit der Abteilung Griesinger auch NMR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich deutlich, dass die Modifikationen einen Einfluss auf die Selbstpaarung hatten. Der Einbau der geladenen Aminosäuren Lysin und Glutamin führte zu einer Verbesserung der Löslichkeit. Die NMR-spektroskopischen Messungen zeigten, dass die Aggregation in reinen G/C-Alanyl-PNA Oligomeren höher ist als die der Oligomere mit Modifikationen. Eine Rückgratmethylierung versprach Abhilfe hinsichtlich Aggregation im für die NMR-Spektroskopie erforderlichen Konzentrationsbereich. Eine N-terminale N-methylierte Nucleoaminosäure im Oligomer 67 brachte keine Abhilfe bei der Vermeidung der Aggregation. Die Messung zentral eingebauter N methylierter Nucleoaminosäure im Oligomer 68 wird noch NMR-spektroskopisch ermittelt.Viertens, befassten wir uns mit den Schalter Funktionen und somit den Wechselwirkungender alternierenden alanly-PNA Oligomere. Beim Einbau von Alanyl-PNA Oligomeren in β-Faltblatt bildende Peptide, sollte der Einfluss der Alanyl-PNAs und damit die Schaltfähigkeit der Sekundärstruktur untersucht werden. Die Peptid/PNA Sequenz Ac Ser-Pro-Gly-Lys-Thr-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gly-Orn-Lys-Ile-Leu-Gln-Val-Gly-Pro-Gly-Gly-AlaC-AlaC-AlaG-AlaC-AlaG-AlaG-Lys-NH2 (85) konnte hergestellt werden, jedoch nicht mit seinem Gegenstrang zur Paarung gebracht werden. Dies kann auf sterische Faktoren sowie Wechselwirkungen der Nucleoaminosäuren der Alanyl-PNA mit den Aminosäuren aus dem Peptid hinweisen. Um eine bessere Wechselwirkung mit komplämemtären Alanyl-PNA Oligomeren zu erreichen, wurde ein kürzeres, weniger rigides Peptid Ac-Orn-Lys-Ile-Leu-Gln-Val-Gly-Asn-Gly-Gly-AlaC-AlaC-AlaG-AlaC-AlaG-AlaG-Lys-NH2 (87) mit schwächerem turn-Bildner hergestellt. Erwartungsgemäß wurde hierbei ein viel größerer Einfluss des Gegenstranges auf die Peptid/PNA Sequenz beobachtet.Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Einbau eines PNA-Hexamers in ein menschliches Interleukin 8 (hIL-8) bzw. in einen Teil dieser Sequenz (Aminosäure 56 bis 77). Es sollte gezeigt werden, dass auch ein Hexamer durch die Technik der native chemical ligation in größere Peptide eingebaut werden kann. Weiterhin, sollte gezeigt werden, dass die Struktur des C-terminalen Endes durch zugabe eines komplementären Gegenstranges in eine stabiele Sekundärstruktur überführt werden kann. Hierfür wurde im Arbeitskreis Beck-Sickinger ein Teil des humanen Interleukin-8 hIL-8 (1-55), als C-terminaler Thioester durch Expression des Fusionsproteins in E. coli und expressed protein ligation.Der letzte Punkt dieser Arbeit war eine enzymatische Ligation in Kooperation mit dem Arbeitskreis Bordusa. Hierbei sollten Alanyl-PNA Oligomere verschiedener Länge sowie N-terminale Nucleoaminosäuren mittels Enzym Clostripain an verschiedene Sequenzen ligiert werden.Die Bordusa Ligationen stellten sich als eine erfolgreiche und gute Methode zum Einbau von Alanyl-PNA in größere Peptide dar. Die manuelle Synthese war nur durch Verlängerung der Sequenz um zwei Glycine möglich. Insgesamt konnte in dieser Arbeit eine viel versprechende neue Synthese zur Darstellung von N methylierten Aminosäuren sowie Nucleoaminosäuren entwickelt und deren Einbau in Oligomere gezeigt werden. Die Ligationsmethode von Bordusa stellt eine sehr effiziente Methode dar, um die Alanyl-PNA Oligomere in große Systeme einzubauen und wird aufgrund dieses Erfolges sicherlich eine gute Option auch zur Darstellung des Interleukin-8 Derivates und weiterer größerer Peptid/PNASequenzen sein. Zur Optimierung dieser Schaltfunktion wäre es denkbar, eine N-metylierte Alanyl-PNA in den Komplementärstrang einzubauen. Eine weitere Möglichkeit zur Optimierung wäre ein Einbau von Aminosäuren gegensätzlicher Ladung in die Oligomere.