Characterization of Synaptotagmin Function In Calcium Dependent Neuronal Exocytosis
Charakterisierung der Funktion von Synaptotagmin bei der Calcium-abhängigen neuronalen Exozytose
by Anand Radhakrishnan
Date of Examination:2007-05-04
Date of issue:2007-08-17
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Referee:Prof. Dr. Ivo Feußner
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Size:10.7Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Synaptotagmin 1 is a synaptic vesicle protein believed to be the calcium sensor at the neuronal synapse. The protein consists of two calcium dependent membrane binding domains known as the C2 domains. Previous studies have shown that deletion of Synaptotagmin 1 results in a loss of calcium dependent secretion at the synaptic terminal. More recently, much work has focused on unravelling the molecular mechanism of Synaptotagmin 1 function. However, due to its highly dynamic and fast action, the biochemical assays required to elucidate its precise function have remained somewhat limited. Conventional methods, such as GST pulldowns and immunoprecipitation lack sufficient resolution to capture the protein ¡§in action¡¨. Currently, it is hypothesised that upon calcium influx into the presynaptic terminal, Synaptotagmin rapidly binds to lipid membrane resulting in the fusion of the synaptic vesicle with the plasma membrane. Recent evidence has also suggested that Synaptotagmin binds to the SNARE complex. The SNARE proteins are a superfamily of proteins that drive membrane fusion. There are two classes of SNARE proteins, the Q-SNARE and the R-SNARE, which forms a four helical bundle, required for the merger of opposing membranes. However, the role and mechanism of the SNARE complex interaction with Synaptotagmin remains unclear. Another SNARE-interacting protein that has been implicated in calcium dependent exocytosis is Complexin. The exact interplay between Complexin and Synaptotagmin is largely unknown although Complexin has been suggested to regulate the interaction of Synaptotagmin with the SNARE complex. Given as such, the major aim of this project was to develop biochemical tools to enable a more precise characterisation of the molecular mechanism of Synaptotagmin action. Due to the inherent functional complexity of the protein, assays that could better define the distinct interactions of Synaptotagmin with its binding partners were developed. The first section of this dissertation focuses on the calcium binding to the C2 domains. This aspect was explored using a method known as isothermal titration calorimetry (ITC). ITC allows the direct determination of parameters such as affinity (K), enthalpy ( ´H), entropy ( ´S) and Gibbs free energy ( ´G) using a single titration experiment. By employing this method, calcium titration into Synaptotagmin revealed that the two C2 domains of Synaptotagmin (namely C2A and C2B) binds calcium with divergent mechanisms and are independent of each other. Furthermore, no additional weak calcium binding sites were evident when calcium was titrated to the C2 domains rendered inactive by site-directed mutagenesis. The second section of this thesis details the use a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based method used to study the binding of Synaptotagmin to liposome membranes. This approach was employed to examine the potential effects of lipid composition and phosphatidylserine (PS) density on Synaptotagmin binding. Interestingly, increasing the amount of PS in the liposome membrane appeared to correspond with an increase the affinity of Synaptotagmin to PS hinting that microdomains might play a role in Synaptotagmin function. The final section of the thesis attempts to further clarify the interaction of Synaptotagmin with the membrane fusion machinery, i.e. SNARE complex. This was achieved using complementary gel-based and fluorescence-based assays to probe the function of the Synaptotagmin ¡V SNARE interaction. Based on the results presented herein, the binding of Synaptotagmin to SNAREs was exclusively observed for both the binary and ternary SNARE complex. In contrast to previous reports, binding of Synaptotagmin to individual Q-SNARE proteins was not detected under the assay conditions outlined in this study. It has also been suggested that Synaptotagmin might play a role in assisting SNARE complex assembly. However based on the findings presented in this study it appears highly unlikely given that the addition of Synaptotagmin both in the absence and presence of calcium does not significantly affect the kinetics of SNARE complex assembly. Finally, the potential role of Complexin in the interplay between Synaptotagmin and the SNARE complex was studied using a FRET-based assay. Synaptotagmin was able to bind to the SNARE complex in the presence of Complexin, but only in the presence of calcium. In the absence of calcium, the interaction between Synaptotagmin and the SNARE complex was abolished. Collectively, the findings of this thesis provide important new insights into the function of Synaptotagmin. However, future work remains to elucidate the exact molecular details of Synaptotagmin action in calcium-dependent exocytosis.
Keywords: Synaptotagmin; Neurobiology; Membrane Transport; Protein Biochemistry
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Es wird vermutet, dass das Protein Synaptotagmin 1, das in der Membrane des synaptischen Vesikels sitzt, der Kalziumsensor in der neuronalen Synapse ist. Synaptotagmin 1 hat zwei sogenannte C2 Domänen, die kalziumabhängig Membranen binden. Es ist gezeigt worden, dass die Deletion von Synaptotagmin zum Verlust der kalziumabhängigen Sekretion an der Synapse führt. In letzter Zeit haben sich Arbeiten darauf konzentriert den molekularen Wirkungsmechanismus von Synaptotagmin aufzuklären. Die hochdynamische und schnelle Wirkweise dieses Proteins stellt jedoch hohe Anforderungen an biochemische Methoden zu seiner Untersuchung, die von konventionelle Methoden ohne zeitliche Auflösung wie GST-Bindungsstudien und Immunuopräzipitation nicht erfüllt werden. Zur Zeit wird eine Hypothese favorisiert, nach der der Einstrom von Kalzium in die präsynaptische Zelle die schnelle Bindung von Synaptotagmin an die Lipidmembran bewirkt. Dies wiederum führt zur Fusion des synaptischen Vesikels mit der Plasmamembran. Daneben wurde auch gezeigt, dass Synaptotagmin an den neuronalen SNARE-Komplex bindet. SNARE Proteine bilden eine Proteinsuperfamile, die an der Membranfusion beteiligt ist. Sie wird in zwei Klassen unterteilt, die Q-SNAREs und die R-SNAREs, die das für das Verschmelzen zweier Membranen benötigte Vier-Helix-Bündel bilden. Die Funktion der Interaktion Synaptotagmins mit dem SNARE-Komplex ist jedoch weitgehend ungeklärt. Complexine bilden eine weitere Familie von Proteinen, die mit dem neuronalen SNARE-Komplex interagieren and an der Regulation der kalziumabhängigen Exozytose beteiligt sind. Das Zusammenspiel von Complexin und Synaptotagmin ist weitgehend unverstanden, auch wenn vorgeschlagen wurde, dass Complexin die Interaktion von Synaptotagmin mit dem SNARE-Komplex reguliert. Der Hauptzweck dieser Arbeit ist daher die Entwicklung biochemischer Methoden zur genaueren Charakterisierung des molekularen Wirkungsmechanismus von Synaptotagmin. Wegen der funktionellen Komplexität Synaptotagmins wurden Methoden entwickelt! , die es erlauben, Interaktionen mit verschiedenen Bindungspartnern getrennt voneinander zu betrachten. Im ersten Abschnitt dieser Dissertation beschäftige ich mich mit der Kalziumbindung durch die C2 Domänen. Dieser Aspekt wurde durch isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht. ITC erlaubt die direkte Bestimmung thermodynamischer Parameter einer Interaktion wie der Affinität, der Enthalpy, der Entropie und der Freien Enthalpy aus einem einzigen Titrationsexperiment. Durch Anwendung dieser Methode wurde gezeigt, dass die beiden C2 Domänen Synaptotagmins (genannt C2A und C2B) Kalzium über verschiedene Mechanismen binden und voneinander unabhängig agieren. In Experimenten mit Mutanten von Synaptotagmin, in denen die bekannten Kalziumbindungsstellen mutiert waren, wurde außerdem gezeigt, dass Synaptotagmin keine weiteren Kalziumbindungsstellen geringerer Affinität aufweist. Der zweite Abschnit behandelt Untersuchungen zur Bindung von Synaptotagmin an Liposomenmembranen. Dazu wurden Methoden verwendet, die auf dem Phänomen des fluorescence resonance energy transfer (FRET) beruhen. Es wurde der Einfluß der Lipidkomposition und der Dichte von Phosphatidylserin (PS) auf die Bindung von Synaptotagmin untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass eine Erhöhung der PS-Menge in der Liposomenmebran zu einer erhöhten Affinität für die Bindung von Synaptotagmin führt. Dies ist ein Hinweis dafür, dass die Bildung von Mikrodomänen eine Rolle bei der Interaktion von Synaptotagmin mit der Membran spielen könnte. Im letzten Abschnitt wurde versucht, das Zusammenspiel von Synaptotagmin mit der Fusionmaschinerie, den SNARE Proteinen, näher zu beleuchten. Um diese Interaktion zu untersuchen, wurden gelelektrophoretische und fluoreszenzspektroskopische Methoden verwendet. Dabei wurde gezeigt, dass Synaptotagmin ausschließlich mit binären und ternären SNARE Komplexen interagiert. Frühere Untersuchungen konnten nicht bestätigt werden, in denen eine Bindung von Synaptotagmin an einzelne Q-SNAREs gezeigt worden war. Auch die Behauptung, Synaptotagmin würde bei der Assemblierung der SNARE Proteine assistieren, konnte nicht bestätigt werden: Synaptotagmin beeinflusste die Kinetik der Assemblierung weder in der Gegenwart noch in Abwesenheit von Kalzium. Zuletzt wurde der Einfluß von Complexin auf die Synaptotagmin-SNARE Interaktion durch FRET-basierte Methoden untersucht. Es wurde gezeigt, dass Synaptotagmin den SNARE Komplex in der Gegenwart von Complexin bindet, jedoch nur bei Anwesenheit von Kalzium. In Abwesenheit von Kalzium interagierte Synaptotagmin hingegen nicht mit dem SNARE Komlex, wenn Complexin zugegen war . Diese Arbeit präsentiert wichtige neue Einblicke in die Funktionsweise von Synaptotagmin. Zukünftige Arbeiten müssen sich nun mit der Aufklärung des exakten molekularen Wirkungsmechanismus von Synaptotagmin bei der kalziumabhägigen Exozytose beschäftigen.
Schlagwörter: Synaptotagmin; Neurobiologie; Membrantransport; Protein Biochemie