Characterization of Synaptotagmin Function In Calcium Dependent Neuronal Exocytosis

Abstract

Es wird vermutet, dass das Protein Synaptotagmin 1, das in der Membrane des synaptischen Vesikels sitzt, der Kalziumsensor in der neuronalen Synapse ist. Synaptotagmin 1 hat zwei sogenannte C2 Domänen, die kalziumabhängig Membranen binden. Es ist gezeigt worden, dass die Deletion von Synaptotagmin zum Verlust der kalziumabhängigen Sekretion an der Synapse führt. In letzter Zeit haben sich Arbeiten darauf konzentriert den molekularen Wirkungsmechanismus von Synaptotagmin aufzuklären. Die hochdynamische und schnelle Wirkweise dieses Proteins stellt jedoch hohe Anforderungen an biochemische Methoden zu seiner Untersuchung, die von konventionelle Methoden ohne zeitliche Auflösung wie GST-Bindungsstudien und Immunuopräzipitation nicht erfüllt werden. Zur Zeit wird eine Hypothese favorisiert, nach der der Einstrom von Kalzium in die präsynaptische Zelle die schnelle Bindung von Synaptotagmin an die Lipidmembran bewirkt. Dies wiederum führt zur Fusion des synaptischen Vesikels mit der Plasmamembran. Daneben wurde auch gezeigt, dass Synaptotagmin an den neuronalen SNARE-Komplex bindet. SNARE Proteine bilden eine Proteinsuperfamile, die an der Membranfusion beteiligt ist. Sie wird in zwei Klassen unterteilt, die Q-SNAREs und die R-SNAREs, die das für das Verschmelzen zweier Membranen benötigte Vier-Helix-Bündel bilden. Die Funktion der Interaktion Synaptotagmins mit dem SNARE-Komplex ist jedoch weitgehend ungeklärt. Complexine bilden eine weitere Familie von Proteinen, die mit dem neuronalen SNARE-Komplex interagieren and an der Regulation der kalziumabhängigen Exozytose beteiligt sind. Das Zusammenspiel von Complexin und Synaptotagmin ist weitgehend unverstanden, auch wenn vorgeschlagen wurde, dass Complexin die Interaktion von Synaptotagmin mit dem SNARE-Komplex reguliert. Der Hauptzweck dieser Arbeit ist daher die Entwicklung biochemischer Methoden zur genaueren Charakterisierung des molekularen Wirkungsmechanismus von Synaptotagmin. Wegen der funktionellen Komplexität Synaptotagmins wurden Methoden entwickelt! , die es erlauben, Interaktionen mit verschiedenen Bindungspartnern getrennt voneinander zu betrachten. Im ersten Abschnitt dieser Dissertation beschäftige ich mich mit der Kalziumbindung durch die C2 Domänen. Dieser Aspekt wurde durch isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht. ITC erlaubt die direkte Bestimmung thermodynamischer Parameter einer Interaktion wie der Affinität, der Enthalpy, der Entropie und der Freien Enthalpy aus einem einzigen Titrationsexperiment. Durch Anwendung dieser Methode wurde gezeigt, dass die beiden C2 Domänen Synaptotagmins (genannt C2A und C2B) Kalzium über verschiedene Mechanismen binden und voneinander unabhängig agieren. In Experimenten mit Mutanten von Synaptotagmin, in denen die bekannten Kalziumbindungsstellen mutiert waren, wurde außerdem gezeigt, dass Synaptotagmin keine weiteren Kalziumbindungsstellen geringerer Affinität aufweist. Der zweite Abschnit behandelt Untersuchungen zur Bindung von Synaptotagmin an Liposomenmembranen. Dazu wurden Methoden verwendet, die auf dem Phänomen des fluorescence resonance energy transfer (FRET) beruhen. Es wurde der Einfluß der Lipidkomposition und der Dichte von Phosphatidylserin (PS) auf die Bindung von Synaptotagmin untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass eine Erhöhung der PS-Menge in der Liposomenmebran zu einer erhöhten Affinität für die Bindung von Synaptotagmin führt. Dies ist ein Hinweis dafür, dass die Bildung von Mikrodomänen eine Rolle bei der Interaktion von Synaptotagmin mit der Membran spielen könnte. Im letzten Abschnitt wurde versucht, das Zusammenspiel von Synaptotagmin mit der Fusionmaschinerie, den SNARE Proteinen, näher zu beleuchten. Um diese Interaktion zu untersuchen, wurden gelelektrophoretische und fluoreszenzspektroskopische Methoden verwendet. Dabei wurde gezeigt, dass Synaptotagmin ausschließlich mit binären und ternären SNARE Komplexen interagiert. Frühere Untersuchungen konnten nicht bestätigt werden, in denen eine Bindung von Synaptotagmin an einzelne Q-SNAREs gezeigt worden war. Auch die Behauptung, Synaptotagmin würde bei der Assemblierung der SNARE Proteine assistieren, konnte nicht bestätigt werden: Synaptotagmin beeinflusste die Kinetik der Assemblierung weder in der Gegenwart noch in Abwesenheit von Kalzium. Zuletzt wurde der Einfluß von Complexin auf die Synaptotagmin-SNARE Interaktion durch FRET-basierte Methoden untersucht. Es wurde gezeigt, dass Synaptotagmin den SNARE Komplex in der Gegenwart von Complexin bindet, jedoch nur bei Anwesenheit von Kalzium. In Abwesenheit von Kalzium interagierte Synaptotagmin hingegen nicht mit dem SNARE Komlex, wenn Complexin zugegen war . Diese Arbeit präsentiert wichtige neue Einblicke in die Funktionsweise von Synaptotagmin. Zukünftige Arbeiten müssen sich nun mit der Aufklärung des exakten molekularen Wirkungsmechanismus von Synaptotagmin bei der kalziumabhägigen Exozytose beschäftigen.