Metagenombasierte Isolierung und biochemische Charakterisierung neuartiger stereospezifischer Lipasen für biokatalytische Anwendungen

Abstract

Die Technik des Klonierens von DNA eines bestimmten Standortes, des. sog. Metagenoms, hat in den letzten Jahren erfolgreich dazu beigetragen, das genetische Potential aller dort vorhandenen Mikroorganismen zu erschließen, von denen ca. 95% als bis heute unkultivierbar gelten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses Verfahren genutzt, um aus ölkontaminiertem Boden aus Wietze (Niedersachsen, Deutschland) eine Cosmidbank zu erstellen und diese auf lipolytische Aktivität hin zu durchmustern. Hierbei wurden zwei neuartige Gene, lipCE und estCE, identifiziert, die für eine neuartige Lipase und eine Esterase kodieren. Die Esterase EstCE wies Ähnlichkeit zu ß-Laktamasen auf und konnte so in die Lipasefamilie VIII eingruppiert werden, während die Lipase LipCE hohe Ähnlichkeit zu extrazellulären Pseudomonas fluorescens-Lipasen der Familie I.3 aufwies. Beide Enzyme wurden in Escherichia coli heterolog exprimiert, gereinigt und mit Hinblick auf biokatalytische Anwendungen charakterisiert. EstCE wies ein Temperaturoptimum von 47°C und ein sehr hohes pH-Optimum von pH 10 verbunden mit hoher Stabilität bei alkalischen pH-Werten auf. Es wurden ausschließlich Ester kurzkettiger Fettsäuren umgesetzt, zudem wurde eine stereospezifische Umsetzung von (+)-Menthylacetat gefunden. Trotz der hohen Ähnlichkeit zu ß-Laktamasen konnte jedoch keine Aktivität gegenüber diesen Antibiotika festgestellt werden. Die Lipase LipCE setzte bevorzugt Ester mittlerer und langkettiger Fettsäuren um und wurde als psychrophiles Enzym charakterisiert. Das pH-Optimum lag bei pH 7, das Temperaturoptimum bei 30°C mit einer Restaktivität von 28% bei 0°C, verbunden mit einer geringen Stabilität bei höheren Temperaturen. Das Enzym benötigte Calcium als Cofaktor, welches die Stabilität und Aktivität wesentlich verbesserte. Durch CD-spektroskopische Untersuchungen konnten Veränderungen in der Sekundärstruktur in Gegenwart von Calcium nachgewiesen werden. LipCE setzte stereospezifisch pharmazeutisch wichtige Substrate wie Ibuprofen (91% ee, (R)-Enantiomer) um und wies eine hohe Selektivität bei der Umsetzung primärer Alkohole gegenüber sekundären und tertiären auf. Zur Entwicklung neuer Techniken wurde zudem ein DNA-Microarray konstruiert, der das Detektieren von Lipasegenen in Umweltproben erlauben soll. Dieser wurde erfolgreich zum Nachweis von Lipasegenen in Anreicherungskulturen und Biofilmen eingesetzt.