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Metagenombasierte Isolierung und biochemische Charakterisierung neuartiger stereospezifischer Lipasen für biokatalytische Anwendungen

dc.contributor.advisorStreit, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.contributor.authorElend, Christiande
dc.date.accessioned2012-04-16T14:50:42Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:47Zde
dc.date.issued2007-08-31de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACD4-7de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-227
dc.description.abstractDie Technik des Klonierens von DNA eines bestimmten Standortes, des. sog. Metagenoms, hat in den letzten Jahren erfolgreich dazu beigetragen, das genetische Potential aller dort vorhandenen Mikroorganismen zu erschließen, von denen ca. 95% als bis heute unkultivierbar gelten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses Verfahren genutzt, um aus ölkontaminiertem Boden aus Wietze (Niedersachsen, Deutschland) eine Cosmidbank zu erstellen und diese auf lipolytische Aktivität hin zu durchmustern. Hierbei wurden zwei neuartige Gene, lipCE und estCE, identifiziert, die für eine neuartige Lipase und eine Esterase kodieren. Die Esterase EstCE wies Ähnlichkeit zu ß-Laktamasen auf und konnte so in die Lipasefamilie VIII eingruppiert werden, während die Lipase LipCE hohe Ähnlichkeit zu extrazellulären Pseudomonas fluorescens-Lipasen der Familie I.3 aufwies. Beide Enzyme wurden in Escherichia coli heterolog exprimiert, gereinigt und mit Hinblick auf biokatalytische Anwendungen charakterisiert. EstCE wies ein Temperaturoptimum von 47°C und ein sehr hohes pH-Optimum von pH 10 verbunden mit hoher Stabilität bei alkalischen pH-Werten auf. Es wurden ausschließlich Ester kurzkettiger Fettsäuren umgesetzt, zudem wurde eine stereospezifische Umsetzung von (+)-Menthylacetat gefunden. Trotz der hohen Ähnlichkeit zu ß-Laktamasen konnte jedoch keine Aktivität gegenüber diesen Antibiotika festgestellt werden. Die Lipase LipCE setzte bevorzugt Ester mittlerer und langkettiger Fettsäuren um und wurde als psychrophiles Enzym charakterisiert. Das pH-Optimum lag bei pH 7, das Temperaturoptimum bei 30°C mit einer Restaktivität von 28% bei 0°C, verbunden mit einer geringen Stabilität bei höheren Temperaturen. Das Enzym benötigte Calcium als Cofaktor, welches die Stabilität und Aktivität wesentlich verbesserte. Durch CD-spektroskopische Untersuchungen konnten Veränderungen in der Sekundärstruktur in Gegenwart von Calcium nachgewiesen werden. LipCE setzte stereospezifisch pharmazeutisch wichtige Substrate wie Ibuprofen (91% ee, (R)-Enantiomer) um und wies eine hohe Selektivität bei der Umsetzung primärer Alkohole gegenüber sekundären und tertiären auf. Zur Entwicklung neuer Techniken wurde zudem ein DNA-Microarray konstruiert, der das Detektieren von Lipasegenen in Umweltproben erlauben soll. Dieser wurde erfolgreich zum Nachweis von Lipasegenen in Anreicherungskulturen und Biofilmen eingesetzt.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleMetagenombasierte Isolierung und biochemische Charakterisierung neuartiger stereospezifischer Lipasen für biokatalytische Anwendungende
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedMetagenome based isolation and biochemical characterization of novel stereospecific lipases for biocatalytical applicationsde
dc.contributor.refereeStreit, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.date.examination2006-11-01de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengThe technique of cloning DNA from a certain habitate, the so called metagenome contributed in the last years successfully to the accession of the genetic potential of all present microorganisms, from which 95% are not yet culturable. In this project the metagenome technique was applied to construct a cosmid library from oil contaminated soil from the town of Wietze (Lower Saxony, Germany) and screen it for the presence of lipolytic activity. Two novel genes, lipCE and estCE, were detected, which encoded for a novel lipase and an esterase. The esterase EstCE showed homology to ß-lactamases and could be grouped into lipase family VII, while lipase LipCE showed high homology to extracellular Pseudomonas fluorescens lipases from family I.3. Both enzymes were heterologously expressed in Escherichia coli, purified and characterized with regard to biocatalytical applications. EstCE had a temperature optimum of 47°C and a high pH optimum of pH 10 together with high stability at alkaline pH values. It converted exclusively esters of short chain fatty acids, furthermore a stereospecific conversion of (+)-menthyl acetate was found. Despite the high homology to ß-lactamases no activity against antibiotics of this class was found. The lipase LipCE preferred esters of medium and long chained fatty acids and was characterized as a psychrophilic enzyme. The pH optimum was pH 7, the temperature optimum was 30°C with residual activity of 28% at 0°C, together with low stability at higher temperatures. The enzyme needed calcium as a co-factor, which improved activity and stability. By CD spectroscopy changes in the secondary structure in the presence of calcium could be demonstrated. LipCE converted stereospecifically pharmaceutical important substrates like Ibuprofen (91% ee, (R) enantiomer) and showed high selectivity for esters of primary over secondary and tertiary alocohols. To develop novel techniques, a DNA microarray was constructed to detect lipase genes in environmental samples. This microarray was successfully used to detect lipase genes in enrichment cultures and biofilms.de
dc.contributor.coRefereeLiebl, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerMetagenomde
dc.subject.gerLipasede
dc.subject.gerBiokatalysede
dc.subject.gerKälteaktive Enzymede
dc.subject.gerStereospezifitätde
dc.subject.gerIbuprofende
dc.subject.gerMenthylacetatde
dc.subject.gerDNA-Microarrayde
dc.subject.engmetagenomede
dc.subject.engbiocatalysisde
dc.subject.engcold-active enzymesde
dc.subject.engstereospecificityde
dc.subject.engibuprofende
dc.subject.engmenthyl acetatede
dc.subject.engDNA-microarrayde
dc.subject.bk42.13de
dc.subject.bk42.30de
dc.subject.bk58.30de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1565-7de
dc.identifier.purlwebdoc-1565de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWUE000de
dc.subject.gokfullWUO400de
dc.subject.gokfullWUV000de
dc.identifier.ppn587184434de


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