Carbon Catabolism in <i>Bacillus subtilis</i>: Global and Molecular Views on the Control of Gene Expression

Abstract

Als Bodenbakterium ist Bacillus subtilis in seinem natürlichen Lebensraum häufig wechselnden Umweltbedingungen ausgesetzt. Zudem ist B. subtilis in seinem Habitat von zahlreichen weiteren Mikroorganismen umgeben, welche mit ihm um die verfügbaren Ressourcen konkurrieren. Zur Überlebensstrategie von B. subtilis gehört es daher, die vorhandenen Nährstoffe möglichst schnell aufzunehmen und zu verwerten. Hierbei ist Glukose seine bevorzugte Kohlenstoffquelle. Die Aufnahme der Glukose erfolgt über das Phosphoenolpyruvat:Zucker Phosphotransferase System (PTS), welches durch das ptsGHI-Operon kodiert wird. Die Expression dieses Operons sowie die Expression einiger weiterer zuckerspezifischer Permeasen werden durch transkriptionelle Antitermination kontrolliert. Hierbei kann die mRNA dieser Gene im 5' Bereich eine von zwei alternativen Sekundärstrukturen annehmen. Bei Ausbildung des thermodynamisch stabileren Terminators kommt es zum vorzeitigen Abbruch der Transkription. Bindet jedoch das Antiterminatorprotein GlcT an diesen Bereich der mRNA, so wird die Antiterminator-Struktur RAT stabilisiert und die Ausbildung des Terminators verhindert. Die Aktivität von GlcT wird durch die Verfügbarkeit von Glukose reguliert. Nur wenn Glukose vorhanden ist, kann GlcT an das RAT binden und es stabilisieren. In B. subtilis gibt es drei weitere PTS abhängige Antiterminationssysteme, welche durch das Vorhandensein von Saccharose oder β-Glucosiden reguliert werden. Sowohl die Antiterminatorproteine als auch die zugehörigen RATs dieser Systeme weisen eine starke Homologie zueinander auf. Dennoch erkennen die Antiterminatorproteine spezifisch ihre jeweilige RAT-Struktur. In dieser Arbeit sollten die Spezifitätsdeterminanten aller verwandten Antiterminationssysteme gefunden werden. Durch ortsgerichtete Mutagenesen zweier unterschiedlicher RATs sollten die Nukleotide identifiziert werden, welche für die spezifische Interaktion mit dem zugehörigen Antiterminatorprotein essenziell sind. Außerdem sollte getestet werden, ob es möglich ist, die Spezifität zugunsten eines anderen Antiterminatorproteins zu verändern. Um mehrere ortsgerichtete Mutagenesen parallel durchführen zu können, wurde die MMR (Multiple Mutation Reaction) als neue Methode etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass sich die für die Spezifität wichtigen Nukleotide ausschließlich im unteren Schleifen-Bereich der verwandten RAT-Strukturen befinden. Durch gezielte Mutationen in diesem Bereich war es zudem möglich, die Spezifität der RATs zugunsten anderer Antiterminatorproteine zu verändern. Die Interaktion der Antiterminatorproteine mit ihrer zugehörigen Permease, welche sich für die direkte Regulation des jeweiligen Antiterminatorproteins verantwortlich zeigt, ist spezifisch und trägt zur Spezifität des Gesamtsystems bei. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch die Katabolitenrepression essenziell für die Aufrechterhaltung der Spezifität ist und Überschneidungen unter den verwandten Systemen verhindert.Zur Verwertung seiner bevorzugten C-Quelle Glukose steht B. subtilis der komplette Satz an Enzymen für Glykolyse, Pentose-Phosphat-Weg, Zitronensäure Zyklus und Atmungskette zur Verfügung. Gleichzeitig reprimiert die Anwesenheit von Glukose die Expression der Gene, welche für die Verwertung von anderen C-Quellen benötigt werden. Erst wenn Glukose verbraucht ist, werden die Gene für die Verwertung anderer C Quellen induziert. Dieser als Katabolitenrepression bezeichnete Effekt war bereits Mittelpunkt zahlreicher Untersuchungen.Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es daher, bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glukose, den Einfluss der organischen Säuren Glutamat und Succinat auf den zentralen Stoffwechsel von B. subtilis zu untersuchen. Hierzu wurden Transkriptomdaten, welche mit DNA-Microarrays gewonnen wurden, sowie Daten aus metabolischen Flussanalysen kombiniert. Die Ergebnisse beider Methoden stimmen für den Großteil der untersuchten Stoffwechselwege sehr gut überein. Die Zugabe von Glutamat und Succinat hat keinen Effekt auf die Gene der Glykolyse und des Pentose Phosphat Wegs. Der Zufluss von Acetyl CoA in den Zitronensäure-Zyklus ist jedoch stark reduziert, wohingegen die Aktivität der Enzyme für die Überfluss-Stoffwechselwege der Lactat- und Acetat-Synthese stark erhöht ist. Für einige wenige Gene wirkt sich die Änderung in der Genexpression jedoch nicht wie erwartet auf den metabolischen Fluss aus. Dies gilt besonders für die Gene der Acetoin-Biosynthese. Trotz einer starken Induktion der beteiligten Gene konnte keine Synthese von Acetoin beobachtet werden. Derartige Abweichungen können Hinweise darauf geben, dass die Aktivität der beteiligten Enzyme auf Proteinebene reguliert wird.