Chararcterisation of fungal protein kinases involved in the regulation of the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae and of sexual development in Aspergillus nidulans

Abstract

In dieser Arbeit wurden einfache Modellorganismen, die Hefe Saccharomyces cerevisiae und der filamentöse Pilz Aspergillus nidulans, zur Charakterisierung von verschiedenen Faktoren genutzt, die an der Regulation des Zellzyklus und der Entwicklung beteiligt sind. In der Hefe wurde Clb5, eine regulatorische Untereinheit von Zyklin-abhängigen Kinasen, und Ime2, eine Proteinkinase mit essentiellen Funktionen im meiotischen Zellzyklus, untersucht. Im filamentösen Pilz wurde die Proteinkinase ImeB, welche eine wichtige Rolle in der Regulation der asexuellen und sexuellen Fruchtkörperbildung hat, charakterisiert. Im erstem Teil des Projektes wurde der Abbauweg des S-Phase Zyklins Clb5 aus der Hefe analysiert. Clb5 ist ein Substrat des Anaphase Promoting Complexes (APC/C), einer Ubiquitin-Ligase, die unentbehrlich für den Zellzyklus ist. Pulsmarkierungs-Experimente wurden zur Bestimmung der Halbwertszeit von Clb5 angewandt. Im Gegensatz zu anderen Zyklinen konnte für Clb5 gezeigt werden, dass es während des ganzen Zellzyklus und sogar in Abwesenheit von APC Aktivität instabil ist. Die Halbwertszeit von Clb5 wurde in Anwesenheit von APC Aktivität noch weiter vermindert. Diese Resultate deuten darauf hin, dass zwei Abbauwege, ein APC abhängiger und ein APC unabhängiger mit überlappenden Funktionen vorhanden sind, um den Clb5 Abbau während des Zellzyklus einzuleiten. Der Abbau ist vom 26 S Proteasom abhängig. Das Ziel des zweiten Pojektes war es, ein besseres Verständnis über die Regulation der Proteinkinase Ime2 aus der Hefe zu erlangen. Diese Kinase und die Zyklin-abhängige Kinase Cdk1 haben viele gemeinsame Funktion in der Regulation der Meiose. Ime2 wird nicht duch Zykline reguliert, ist aber selbst ein instabiles Protein. Durch Konstruktion einer Reihe von Deletionen wurde gezeigt, dass die C- terminale Region für die Ime2 Instabilität essentiell ist und vermutlich mehrere überlappende Abbausignale beinhaltet. Ein verkürztes Ime2, welchem am C-Terminus 242 Aminosäuren fehlen, ist stabil und aktiv. Expression dieser Ime2 Version während der Meiose verhindert nicht die meiotische Zellteilung, resultiert aber in einer abnormalen Sporenbildung. Häufig hatten Asci eine verminderte Sporenanzahl und waren meistens Dyaden. Demnach ist die Ime2 Instabilität, welche durch die C-terminale Region vermittelt wird, für die effiziente Einschliessung der Kerne in Sporenwände und für die Bil! dung von normalen 4-sporige Asci wichtig. Im letzten Teil des Projektes wurde das Ime2 Homologe in A.nidulans, ImeB, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde ein imeB Deletionsstamm erzeugt. Auf Agarplatten zeigten imeBdelta Mutanten ein langsames Wachstum, hatten aber eine erhöhte Bildung von sexuellen Fruchtkörpern, den Kleistothezien. Im Gegensatz zum Wildtyp bildeten imeBdelta Stämme typische sexuelle Strukturen, wie die globulären Hülle-Zellen, in Flüssigkultur. Überexpression von imeB verhindert die Bildung von Konidiophoren bei Wachstum im Dunkeln. imeB Transkripte erhöhten sich während des asexuellen und sexuellen Lebenszyklus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ImeB als Regulator der Entwicklung von A.nidulans wirkt. Im Gegensatz zum Ime2 Protein der Hefe, scheint ImeB ein Inhibitor des sexuellen Lebenszyklus zu sein. Diese Resultate lassen vermuten, dass diese Proteine in der Evolution gegensätzliche Funktionen als Regulatoren der sexuellen Entwicklung erworben haben. Ime2 und ImeB gehören zu der Familie der Mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAK), welche durch ein TXY motif in der Aktivierungsschleife charakterisiert ist. Punktmutationen in den entsprechenden Codons zeigten, dass jede einzelne Aminosäure dieses Motives für die Ime2 Funktion benötigt wird.