Proteome studies on leaf peroxisomes from Spinacia oleracea L. and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Proteomanalyse von pflanzlichen Peroxisomen begonnen, um unser Verständnis der Funktionen dieser ubiquitären eukaryotischen Zellorganellen zu erweitern. Ein überlieferte Methode zur Isolierung von Blattperoxisomen aus Spinacia oleracea L. wurde durch Ergänzung eines zweiten Saccharose-Dichtegradienten verbessert und führte zur Reduktion der Kontamination von Blattperoxisomen durch Chloroplasten und Mitochondrien auf ein Minimum, während ein neuartigen Typ Proplastiden-ähnlicher Organellen weiterhin detektierbar war. Alternativ wurde für vergleichende Proteomanalysen von gestressten Pflanzen eine Methode von minimalem Zeitumfang entwickelt. Um die Information der ersten pflanzlichen Genomsequenz, der von Arabidopsis thaliana L., für Proteomanalysen auszunutzen, wurde eine neue effiziente Methode zur Anreicherung von Blattperoxisomen entwickelt.Die Methode der zwei-dimensionalen Gelelektrophorese wurde für lösliche Matrixproteine bezüglich der Auswahl und Konzentration chaotroper Reagenzien, Detergenzien und Alkohole optimiert, um maximale Auflösung und Proteinausbeute zu erzielen. Die löslichen Matrixproteine gereinigter Blattperoxisomen wurden durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese gefolgt von Massenspektrometrie (MALDI and ESI-MS/MS) charakterisiert. Über etliche bekannte Proteine pflanzlicher Peroxisomen hinaus, beispielsweise die in Photorespiration, Fettsäure-beta-Oxidation und den Metabolism reaktiver Sauerstoffspezies involvierten Enzyme, wurde einige neue Proteine identifiziert, und zwar eine kurzkettige Alkoholdehydrogenase, ein Naphthoat-Synthase-ähnliches Protein, eine Enoyl-CoA-Hydratase/Isomerase und ein kleines Hitzeschockprotein. Alle vier unbekannten Proteine besitzen ein peroxisomales Zielsteuerungssignal des Typs 1 oder 2, welches in homologen pflanzlichen cDNAs konserviert ist. Die subzelluläre Lokalisation der neuen Proteine wurde durch vergleichende 2D-Gelelektrophorese verifiziert. Die Gene von Arabidopsis, die für das Naphthoat-Synthase-ähnliche Protein und das kleine Hitzeschockprotein kodieren, wurde über Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion von Kälte-behandelten Blättern kloniert und erlauben weitere Untersuchungen zur subzellulären Zielsteuerung sowie funktionelle Analysen.Post-translationale Modifikationen wie Proteinphosphorylierungen scheinen eine verbreitete Eigenschaft mehrerer Peroxisomenproteine wie Katalase, Hydroxypyruvat-Reduktase, Ascorbat-Peroxisdase und Isocitrat-Lyase zu sein. Einige neue Proteine bzw. Isoformen von Blattperoxisomen scheinen ausserdem unter spezifischen Stressbedingungen wie durch oxidativen Stress und unter Hochlicht induziert zu werden und eine wichtige aber bislang völlig unbekannte Rolle in der pflanzlichen Stresstoleranz zu spielen.