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Functional characterization of the human renal organic anion transporter 3 (hOAT3) and comparison to hOAT1

dc.contributor.advisorHardeland, Rüdiger Prof. Dr.de
dc.contributor.authorBakhiya, Nadiyade
dc.date.accessioned2012-04-16T14:51:02Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:28Zde
dc.date.issued2004-06-01de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACEB-6de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-250
dc.description.abstractDie renale Sekretion organischer Anionen ist entscheidend von der basolateralen Aufnahme in das Tubulusepithel entgegen dem elektrochemischen Gradienten abhängig. Aufgrund ihrer basolateralen Lokalisation sind vermutlich zwei Transporter an diesem Prozess beteiligt, der OAT1 und der OAT3. Während der OAT1 als Anionenaustauscher eindeutig in sekretorischer Richtung operiert, sollte der OAT3 in seiner ursprünglich postulierten Funktion als Uniporter anionische Substrate entgegengesetzt, also von der Zelle ins Blut transportieren. In der vorliegenden Studie haben wir daher die Triebkräfte des hOAT3 erneut untersucht. Darüberhinaus wurde der hOAT3 funktionell mit dem hOAT1 verglichen, um ihren jeweiligen Beitrag zur renalen Sekretion typischer physiologischer oder klinisch relevanter Substrate wie Urat oder Diuretika besser zu verstehen. Da der vom Deutschen Ressourcenzentrum für Genomforschung (RZPD) erhaltene Klon aufgrund zweier Punktmutationen nicht funktionsfähig war, mußte er zunächst durch gerichtete Mutagenese korrigiert werden. Anschließend wurde er in Xenopus laevis-Oozyten exprimiert und der von ihm vermittelte Transport von Estronsulfat (ES) und Glutarat (GA) auf Cis-Hemmung und Trans-Stimulation hin untersucht. Die vom hOAT3 vermittelte Substrataufnahme zeigte ähnliche Charakteristika wie der Transport durch den hOAT1: sie war chloridabhängig und wurde durch Dikarboxylate einer Kettenlänge von 5 C-Atomen, wie α-Ketoglutarat (α-KG) und Glutarat, am stärksten gehemmt (90 bzw. 95%). Beide Dikarboxylate erwiesen sich außerdem als Substrate des hOAT3, wenn auch die Affinität des hOAT3 für Glutarat (Km=23.5 µM) etwa um eine Zehnerpotenz kleiner war als die des hOAT1 (Km=2.5 µM). Der hOAT3-vermittelte Efflux von GA konnte im Gegensatz zu dem von ES durch eine Reihe von Anionen signifikant trans-stimuliert werden, so von GA (280%), α-KG (480%), p-Aminohippurat (180%), und bedeutsamerweise auch von Urat (170%). Diese Ergebnisse belegen, dass hOAT3 als Austauscher organischer Anionen gegen Dikarboxylate operiert. Entsprechend sollte er, ähnlich wie der hOAT1, der Sekretion organischer Anionen dienen, getrieben möglicherweise ebenfalls vom zellauswärts-gerichteten α-Ketoglutarat-Gradienten. Verglichen mit dem hOAT1 wies der hOAT3 eine höhere Sensitivität gegenüber Urat auf, sowohl exprimiert in Xenopus-Oozyten als auch in Säugerzellen in Kultur. Daher ist der hOAT3 sehr wahrscheinlich an der renalen Urat-Sekretion beim Menschen beteiligt und könnte hierbei sogar von größerer Bedeutung sein als der hOAT1. In Bezug auf die mögliche Beteiligung von hOAT3 und hOAT1 an der renalen Sekretion von Diuretika konnte für beide Carrier eine Trans-Stimulation sowohl durch Furosemid als auch Hydrochlorothiazid nachgewiesen werden, die belegt, dass beide diese Pharmaka transportieren und damit ihre energieabhängige basolaterale Aufnahme in das Tubulusepithel vermitteln können. Aufgrund seiner höheren Sensitivität gegenüber Furosemid könnte auch hier der hOAT3 die vorrangige Rolle spielen (hOAT3: IC50 = 3µM, hOAT1: IC50 = 490µM). Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass der hOAT3 als Anionenaustauscher operiert und damit an der renalen Sekretion sowohl von endogenen Substraten (z.B. Urat) als auch von Xenobiotika (z.B. Diuretika) beteiligt ist.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isobulde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htmde
dc.titleFunctional characterization of the human renal organic anion transporter 3 (hOAT3) and comparison to hOAT1de
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedFunktionelle Charakterizierung des humanen renalen Transporters für organische Anionen 3 (hOAT3) und Vergleich mit dem hOAT1de
dc.contributor.refereeFigura, Kurt von Prof. Dr. Dr. h.c.de
dc.date.examination2004-05-28de
dc.description.abstractengRenal secretion of organic anions is critically dependent on their basolateral uptake against the electrochemical gradient. Due to their localization, two transporters are likely involved, namely OAT1 and OAT3. While OAT1 as an exchanger clearly operates in the secretory direction, OAT3 in its previously supposed mode as a uniporter should move substrates from cell to blood. Therefore, in the present study the driving forces of human OAT3 were re-investigated. Additionally, hOAT3 was compared to hOAT1 under identical conditions, for a better understanding of their contribution to renal handling of some common physiologically and clinically important substrates (urate, diuretics). As the hOAT3 obtained from a resourcecenter (RZPD) was not functional, it was corrected by site-directed mutagenesis. Using the Xenopus laevis oocyte expression system, hOAT3-mediated transport of estrone sulfate (ES) and glutarate was assayed for cis-inhibition and/or trans-stimulation. The substrate uptake by hOAT3 showed characteristics similar to hOAT1 it was chloride dependent and was most potently inhibited by the C-5 dicarboxylates α-ketoglutarate (α-KG) and glutarate by 90 and 95%, respectively. Both were also substrates for hOAT3, although the apparent affinity of hOAT3 for glutarate (Km=23.5 µM) was about one order of magnitude lower than that of hOAT1 (Km=2.5 µM). It was demonstrated that hOAT3-mediated efflux of glutarate, in contrast to ES, can be significantly trans-stimulated by a variety of ions, including GA (280%), α-KG (480%), p-aminohippurate (180%), and, most notably, urate (170%). These results prove the ability of hOAT3 to operate as an organic ion/dicarboxylate exchanger. Thus, similar to hOAT1, hOAT3 likely functions in the secretory direction in vivo, and possibly also driven by outwardly directed α-KG gradient. hOAT3 showed a higher sensitivity for urate than hOAT1, which was also true when both were expressed in cultured mammalian cells. Thus, hOAT3 is likely to be involved in renal urate secretion and may even predominate over hOAT1 in this process. As for the potential contribution of hOAT3 and hOAT1 to the renal secretion of diuretics, the efflux by both carriers was trans-stimulated by furosemide, as well as hydrochlorothiazide, showing that both can translocate diuretics and thus participate in basolateral uptake of these compounds in exchange for α-KG. While hOAT3 exhibited a far higher sensitivity to inhibition by loop diuretic furosemide than hOAT1 (IC50 of 3µM for hOAT3 versus 490µM for hOAT1), it may play the major role in secretion of this drug. Taken together, the present study establishes hOAT3 as an anion exchanger involved in the secretion of endogenous and exogenous compounds.de
dc.contributor.coRefereeBurckhardt, Gerhard Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeBraus, Gerhard Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerTransporter für organische Anionende
dc.subject.gerhOAT3de
dc.subject.gerhOAT1de
dc.subject.gerUratde
dc.subject.gerDiuretikade
dc.subject.gerNierede
dc.subject.gerproximaler Tubulusde
dc.subject.ger570 Biowissenschaftende
dc.subject.gerBiologiede
dc.subject.engOrganic anion transporterde
dc.subject.enghOAT3de
dc.subject.enghOAT1de
dc.subject.enguratede
dc.subject.engdiureticsde
dc.subject.engkidneyde
dc.subject.engproximal tubulede
dc.subject.bk42.13 Molekularbiologiede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-166-7de
dc.identifier.purlwebdoc-166de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF Molekularbiologiede
dc.identifier.ppn39011152Xde


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