Zur Kurzanzeige

Neue Zugänge zu enantioselektiven lipolytischen Enzymen durch fluoreszenzbasierte Durchmusterung kombinatorischer Bibliotheken

dc.contributor.advisorKolmar, Harald PD Dr.de
dc.contributor.authorBecker, Stefande
dc.date.accessioned2012-04-16T14:51:02Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:28Zde
dc.date.issued2008-01-08de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACEC-4de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-251
dc.description.abstractDie vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Erprobung eines Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahrens zur Identifizierung und Isolierung von Varianten lipolytischer Enzyme mit veränderter Enantioselektivität. Es kombiniert die Zelloberflächenpräsentation lipolytischer Enzyme mit einer neuen Anreicherungsmethode und hat das Potential, die Identifizierung von Varianten mit gewünschten Eigenschaften erheblich zu beschleunigen. Die Präsentation lipolytischer Enzyme auf der Oberfläche von E. coli Zellen wurde durch die rekombinante Produktion betreffender Enzyme als Fusionsproteine mit einer verkürzten, esterolytisch inaktiven Variante der P. aeruginosa Esterase EstA erreicht. Es konnte gezeigt werden, daß mit diesem Verfahren unterschiedliche Passagierproteine aus der Familie der Lipasen präsentiert werden können. Diese Art der rekombinanten Produktion schafft nicht nur eine effiziente Genotyp-Phänotyp-Kopplung zwischen einem Enzym und einem selbstreplizierenden Partikel (Zelle), es ermöglicht außerdem die Immobilisierung des betreffenden Enzyms an einer festen Matrix (Zellwand) im extrazellulären Medium. Dadurch sind oberflächenpräsentierte Enzyme direkt für entsprechende Substrate zugänglich und einfach zu separieren, was sie für die organische Synthese zu nützlichen Werkzeugen als Ganz-Zell-Biokatalysatoren macht. Das vorgestellte Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahren basiert auf der spezifischen Markierung von E. coli Zellen, die Varianten lipolytischer Enzyme auf der Oberfläche präsentieren. Diese Markierung geschieht als Folge einer Substrathydrolyse, wodurch die Aktivität und Substratspezifität einer präsentierten Enzymvariante in Form eines Fluoreszenzsignals auf Einzelzellbasis abgebildet werden kann. Die Nutzung durchflußzytometrischer Methoden gestattete die simultane Durchmusterung einer großen Anzahl von Varianten (>107). Der Einsatz der unterschiedlichen Enantiomere der 2-Methyldekansäure als Ester der Markierungs-Substrate ermöglichte die Identifizierung und Isolierung von Varianten der P. aeruginosa Esterase EstA mit invertierter Enantioselektivität aus zwei durch Zufallsmutagenese erzeugten Enzymbibliotheken. Durch Nukleotidsequenzanalysen dieser Varianten wurde eine für die Enantioselektivität von EstA entscheidende Position in der Aminosäuresequenz identifiziert. Weiterhin konnte die in dieser Arbeit entwickelte Strategie, Proteine durch Exposition auf der bakteriellen Zelloberfläche einer direkten Funktionsabfrage zuzuführen auch auf den Nachweis der Protein-Protein Wechselwirkung der Lipase-spezifischen Foldase LipH aus P. aeruginosa mit der korrespondierenden Lipase LipA angewendet werden.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleNeue Zugänge zu enantioselektiven lipolytischen Enzymen durch fluoreszenzbasierte Durchmusterung kombinatorischer Bibliothekende
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedNovel approaches to enantioselective lipolytic enzymes via fluorescence based screening of combinatorial librariesde
dc.contributor.refereeKramer, Wilfried PD Dr.de
dc.date.examination2007-10-31de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengThis thesis describes the development and evaluation of a high-throughput screening method for the identification and isolation of lipolytic enzyme variants with altered enantioselectivity. It combines the cell surface display of lipolytic enzymes with a novel enrichment method and has the potential to considerably accelerate the identification of variants with desired properties. The E. coli cell surface display of lipolytic enzymes was achieved via recombinant production of the respective enzymes as fusion proteins with a truncated, esterolytic inactive variant of the P. aeruginosa esterase EstA. It was demonstrated that this system is able to mediate the surface display of several members of the family of lipolytic enzymes as passenger proteins. This kind of recombinant production not only creates an efficient genotype-phenotype coupling between an enzyme and a self-replicating particle (cell), it also allows immobilization of the respective enzyme to a solid matrix (cell surface) in the extracellular medium. Thus, surface exposed enzymes are directly accessible to the respective substrates and easily separable, which makes them useful tools as whole cell biocatalysts for organic synthesis. The presented high-throughput screening method is based on a specific labelling of E. coli cells, which display lipolytic enzyme variants on the cell surface. This labelling takes place as result of substrate hydrolysis, thus allowing the mapping of activity and substrate specificity in the form of a fluorescence signal on a single cell basis. The utilization of flow cytometry facilitates the simultaneous screening of a large number of variants (>107). The application of the different enantiomers of 2-methyldecanoic acid as esters of labelling substrates allowed the identification and isolation of P. aeruginosa EstA variants with inverted enantioselectivity from two enzyme libraries generated by random mutagenesis. Nucleotide sequence analysis of those variants revealed an amino a cid position with a decisive role for the enantioselectivity of EstA. Furthermore, it could be demonstrated that the developed strategy to utilize bacterial cell surface display for a direct functional analysis of proteins could be extended to the verification of the protein-protein interaction of the P. aeruginosa lipase-specific foldase LipH with the corresponding lipase LipA.de
dc.contributor.coRefereeDiederichsen, Ulf Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeDaniel, Rolf PD Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gergerichtete Evolutionde
dc.subject.gerbakterielle Zelloberflächenpräsentationde
dc.subject.gerenzymatische Katalysede
dc.subject.gerHydrolasende
dc.subject.gerkinetische Resolutionde
dc.subject.gerasymmetrische Katalysede
dc.subject.engdirected evolutionde
dc.subject.engbacterial cell surface displayde
dc.subject.engenzyme catalysisde
dc.subject.enghydrolasesde
dc.subject.engkinetic resolutionde
dc.subject.engasymmetric catalysisde
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1664-7de
dc.identifier.purlwebdoc-1664de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 200: Molekularbiologiede
dc.identifier.ppn587184892de


Dateien

Thumbnail

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige