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dc.contributor.advisor Zwirner, Jörg Prof. Dr. de
dc.contributor.author Kiafard, Ziba de
dc.date.accessioned 2012-04-16T14:51:05Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:50:48Z de
dc.date.issued 2008-01-29 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACEF-D de
dc.description.abstract Anaphylatoxine sind potente Entzündungsmediatoren, die ihre biologische Wirkung durch eine hochaffine Bindung an spezifische, zelluläre Rezeptoren entfalten. Aufgrund der widersprüchlichen Angaben in der Literatur über die Expression der Anaphylatoxin-Rezeptoren sollten in der vorliegenden Arbeit neue, hochspezifische monoklonale Antikörper gegen den humanen C5aR und erstmals solche Reagenzien gegen den Maus-C3aR hergestellt werden. Mit Hilfe dieser neu generierten monoklonalen Antikörper sollte die Expression sowohl des C5a- als auch des C3a-Rezeptors im normalen und pathologisch veränderten Nierengewebe untersucht werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den humanen C5aR wurden RBL-2H3-Transfektanten eingesetzt, die den Rezeptor auf der Oberfläche exprimieren. Nach Bestimmung der Rezeptorspezifität wurden acht monoklonale Antikörper identifiziert, die den C5aR immunhistochemisch erkannten. Anhand ihrer Reaktivität gegen zwei unterschiedliche Peptide wurden sie in drei Gruppen eingeteilt, die an verschiedene Epitope der N-terminalen Domäne des C5aR binden. Monoklonale Antikörper aller drei Gruppen ließen eine deutliche C5aR-Expression in Gefrierschnitten der menschlichen Niere erkennen, die allerdings auf Zellen des mononukleär-phagozytären Systems beschränkt blieb. Mono- sowie polyklonale Antikörper, die durch Immunisierung mit C5aR-Peptiden generiert worden waren, hatten in der Vergangenheit eine C5aR-Expression auch in tubulären Zellen der menschlichen Niere nachgewiesen. Dieser Befund konnte in der vorliegenden Arbeit mittels der neu hergestellten monoklonalen Antikörper nicht bestätigt werden. Eine immunzytochemische Untersuchung sowie die RT-PCR-Analyse zum Nachweis von C5aR-mRNA in kultivierten proximal tubulären Zellen der Niere erbrachten ebenfalls keinen Hinweis auf eine C5aR-Expression. Für die Generierung monoklonaler Antikörper gegen den murinen C3aR wurden zunächst stabil transfizierte RBL-2H3 Zellen, die den murinen C3aR exprimieren, hergestellt. Mit diesen wurden Lou/C-Ratten immunisiert. Insgesamt konnten sechs monoklonale Antikörper generiert und charakterisiert werden, die zum Nachweis des C3aR sowohl auf Zelloberflächen als auch in den Gefrierschnitten eingesetzt wurden. Mittels Kreuz-Kompetitions-Experimenten konnten mindestens zwei Gruppen von monoklonalen Antikörpern definiert werden, die unterschiedliche Epitope erkennen. Die durchflusszytometrische Untersuchung muriner Zellen mit den neu generierten monoklonalen Antikörpern wies nach, dass der C3aR auf Peritoneal-Makrophagen und auf Makrophagen, die mittels M-CSF aus Knochenmarksvorläuferzellen differenziert wurden, exprimiert wird. Auf neutrophilen Granulozyten konnte keine C3aR-Expression nachgewiesen werden. Dendritische Zellen aus murinem Knochenmark zeigten eine schwache C3aR-Expression. Die Untersuchung von Milzzellen und Thymozyten der Maus belegten, dass der C3aR weder auf T-Lymphozyten noch auf B-Lymphozyten exprimiert wird. Die immunhistochemische Untersuchung von Gefrierschnitten der Niere LPS-behandelter oder an Lupus-Nephritis erkrankter Tiere (MRL/lpr-Mäuse) zeigte, dass beide Anaphylatoxin-Rezeptoren ausschließlich in residenten und infiltrierenden Makrophagen exprimiert werden. Es konnte keine Expression von Anaphylatoxin-Rezeptoren in proximal tubulären Zellen normaler oder entzündlich veränderter Nieren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ziehen eine Beteiligung nicht-myeloischer Zellen an Anaphylatoxin-vermittelten Entzündungsreaktionen in der Niere in Zweifel. Ferner haben unsere Ergebnisse eine über Anaphylatoxin-Rezeptoren hinausgehende Bedeutung, da sie die generelle Notwendigkeit einer kritischen Beurteilung immunhistochemisch erzielter Ergebnisse hervorheben. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso ger de
dc.rights.uri http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html de
dc.title Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen die Anaphylatoxin-Rezeptoren de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Generation and characterization of monoclonal antibodies against the anaphylatoxin receptors de
dc.contributor.referee Liebl, Wolfgang Prof. Dr. de
dc.date.examination 2007-05-03 de
dc.subject.dnb 570 Biowissenschaften, Biologie de
dc.description.abstracteng Anaphylatoxins are potent pro-inflammatory mediators that induce their biological effects through high affinity binding to specific cellular receptors. Due to controversial evidence in the literature on the expression of anaphylatoxin receptors, it was the purpose of the present study to raise novel highly specific monoclonal antibodies against the human C5aR and, for the first time, against the mouse C3aR. These reagents should be applied to investigate, expression of both the C5a and the C3a receptor in normal and diseased kidney tissues. For the generation of monoclonal antibodies against the human C5aR, RBL-2H3 transfectants expressing the receptor on the cell surface were employed. After determining their receptor specificity eight monoclonal antibodies were identified, which recognized the C5aR in immunohistochemistry. On the basis of their reactivity against two different peptides they were arranged in three groups, which bind to distinct epitopes of the N-terminal domain of C5aR. Monoclonal antibodies from these three groups detected a prominent C5aR expression in frozen sections of the human kidney, which was restricted to cells of the mononuclear phagocytic system. Mono- and polyclonal antibodies which had been raised against C5aR peptides, had previously detected C5aR expression also in tubular cells of the human kidney. This finding could not be confirmed using our newly established monoclonal antibodies. Immunocytochemistry along with the RT-PCR analysis of C5aR mRNA in cultivated proximal tubular cells of the kidney also failed to detect C5aR expression. For generating monoclonal antibodies against the murine C3aR stably transfected RBL-2H3 cells that express the murine C3aR were produced, which then served to immunize Lou/C-rats. A total of six monoclonal antibodies could be generated and characterized, which served to detect the C3aR on cell surface as well as in frozen sections. By cross competition experiments at least two groups of monoclonal antibodies were defined, that recognize different epitopes. Flow cytometric investigation of murine cells using the newly generated monoclonal antibodies demonstrated that C3aR is expressed on peritoneal macrophages and on macrophages, which had been differentiated from bone marrow cells by M-CSF. C3aR expression could not be found on neutrophil granulocytes. Dendritic cells from murine bone marrow displayed a weak C3aR signal. Investigation of murine spleen cells and thymocytes demonstrated that C3aR is neither expressed on T lymphocytes nor on B lymphocytes. The immunohistochemical investigation of frozen kidney sections from mice treated with LPS or suffering from lupus-type nephritis (MRL/lpr mice) demonstrated that both anaphylatoxin receptors are expressed exclusively in resident and infiltrated macrophages. No C5a and C3a receptors were detectable in proximal tubular cells of the normal or inflamed kidney. The results of the present study question a role for non-myeloid cells in anaphylatoxin-mediated inflammatory reactions in the kidney. Moreover, the implications of our study may go beyond the narrow scope of anaphylatoxin receptors as they emphasize the need for a critical assessment of immunohistochemically acquired data in general. de
dc.contributor.coReferee Hoyer-Fender, Sigrid PD Dr. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger Komplement de
dc.subject.ger Anaphylatoxin-Rezeptor de
dc.subject.ger C5a de
dc.subject.ger C3a de
dc.subject.ger Monoklonale Antikörper de
dc.subject.ger Immunhistochemie de
dc.subject.ger Niere de
dc.subject.eng Complement de
dc.subject.eng Anaphylatoxin receptor de
dc.subject.eng C5a de
dc.subject.eng C3a de
dc.subject.eng Monoclonal antibody de
dc.subject.eng Immunohistochemistry de
dc.subject.eng Kidney de
dc.subject.bk 42 de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1688-1 de
dc.identifier.purl webdoc-1688 de
dc.affiliation.institute Biologische Fakultät inkl. Psychologie de
dc.subject.gokfull RA 000: Allgemeine Naturwissenschaften de
dc.identifier.ppn 591104903 de

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