Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer RNA-Transportfaktoren in der Xenopus laevis Oozyte
Identification and functional characterization of novel RNA transport factors in Xenopus laevis oocytes
Jana Löber
Doctoral thesis
Date of Examination:
2008-04-29
Date of issue:
2008-06-05
Advisor:
Pieler, Tomas Prof. Dr.
Referee:
Pieler, Tomas Prof. Dr.
Referee:
Wimmer, Ernst A. Prof. Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACF5-E
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Name:
loeber.pdf
Size:
7,9 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
Abstract
English
RNA localization is an important strategy to create intracellular asymmetry and plays an essential role in early embryogenesis in several organisms. Revealing the molecular mechanism of this process and analysing the function of localized RNAs will therefore contribute to the understanding of early development of the embryo. With the aim of isolating novel RNA localization factors from Xenopus laevis oocytes, transgenic frogs were generated, which should express an epitope-tagged version of the transport protein Vg1RBP under the control of the oocyte-specific TFIIIA promoter. Although the transgenic DNA could be detected in the genome of the frogs, the recombinant protein was not expressed. By the use of an alternative strategy protein expression was achieved, and the tagged Vg1RBP was used as bait in an affinity chromatographic protein purification. Through mass spectrometry binding partners were identified and analysed with regard to RNA localization. The identified proteins not only interacted with Vg1RBP, but also with other known localization factors. In addition, it could be shown that one of the identified clones preferentially bound to localized RNA. In the second part of my thesis work, the function of novel localized RNAs was investigated through gain- and loss-of-function experiments in Xenopus laevis embryos. In the third part of the thesis, RNA elements of early vegetally localized RNAs were analysed for their ability to enrich in primordial germ cells and their degradation in the soma of early Xenopus embryos.
Keywords: Vg1RBP; RNA localization; oogenesis; transgenesis; Xenopus laevis
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Die Lokalisierung von RNA-Molekülen ist ein wichtiger Mechanismus zur Schaffung intrazellulärer Asymmetrien und spielt eine bedeutende Rolle in der Embryogenese verschiedener Organismen. Die Aufklärung dieses Prozesses, sowie die funktionelle Analyse lokalisierter RNAs können folglich zum Verständnis der frühen Embryonalentwicklung beitragen. Mit dem Ziel, neue RNA-Lokalisationsfaktoren aus der Xenopus laevis Oozyte zu isolieren, wurden transgene Frösche generiert, die eine Epitop-markierte Version des Transportfaktors Vg1RBP unter der Kontrolle eines Oozyten-spezifischen Promoters exprimieren sollten. Obwohl die transgene DNA in den Tieren nachweisbar war, wurde das rekombinante Protein nicht exprimiert. Die Proteinexpression wurde durch eine alternative Strategie erreicht und eine affinitätschromatographische Proteinaufreinigung durchgeführt. Die identifizierten Vg1RBP-Bindungspartner wurden hinsichtlich ihrer Rolle in der RNA-Lokalisierung analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine nicht nur mit Vg1RBP, sondern auch mit anderen Lokalisationsfaktoren interagieren. Außerdem konnte für eines der identifizierten Proteine eine spezifische Bindung an lokalisierte RNAs nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden bisher nicht beschriebene vegetativ lokalisierte mRNAs funktionell durch gain-of-function und loss-of-function Experimente analysiert. In einem dritten Projekt wurden vegetativ lokalisierte RNAs hinsichtlich der Eigenschaft untersucht, in den somatischen Zellen des frühen Xenopus laevis Embryos degradiert, in den primordialen Keimzellen dagegen angereichert zu werden.
Schlagwörter: Vg1RBP; RNA-Lokalisation; Oogenese; Transgenese; Xenopus laevis
