Kristallstrukturanalyse des spleißosomalen DEAD-Box Proteins hPrp28
Crystal structure analysis of the spliceosomal DEAD-box protein hPrp28
by Sina Möhlmann
Date of Examination:2008-01-23
Date of issue:2008-06-25
Advisor:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Oliver Einsle
Referee:PD Dr. Sigrid Hoyer-Fender
Referee:PD Dr. Susanne Behrens
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-261
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Description:Dissertation
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Abstract
English
DEAD-box proteins belong to the helicase superfamily. They use the energy of ATP hydrolysis to dissociate RNA-RNA or RNA-protein interactions and therefore to catalyze rearrangements in riboncleoprotein complexes. The DEAD-box protein hPrp28 is part of the U5 snRNP of the human spliceosome. It is necessary for the integration of the U4/U6.U5 tri-snRNP into this macromolecular complex and for the subsequent rearrangements leading to an active spliceosome and the first transesterification reaction. It is assumed that hPrp28 catalyzes the exchange of the U1 for the U6 snRNA at the 5 splice site of the pre-mRNA. In this work, the C-terminal helicase domain of hPrp28 was crystallized and its structure was determined by x-ray diffraction experiments. It contains two subdomains each consisting of a central β-sheet surrounded by α-helices. Their structures are very similar to those found in other DEAD-box proteins. Different is the relative orientation of the subdomains which is very open in hPrp28. To characterize the helicase domain of hPrp28 biochemically, interaction studies with putative ligands where undertaken. The investigation of the RNA binding properties using different substrates suggests that it may interact with double stranded RNA. Furthermore, it was shown that the helicase domain of hPrp28 in vitro only binds ADP but not ATP. Correspondingly, no ATPase activity was observed. The molecular structure revealed that the ATP binding site on the helicase domain is in a closed conformation. This is due to the conformation of the P loop which sterically inhibits ATP binding. At the N-terminus, hPrp28 contains an arginine-serine-rich domain. Here it was shown that this domain can be heavily phosphorylated in vitro by the kinases SRPK1 and Clk1. The phosphorylation by SRPK1 concentrates on the first 125 amino acids of hPrp28. In cooperation with Rebecca Mathew and Reinhard Lührmann (MPI, Göttingen) was shown that this phosphorylation is essential for the binding of hPrp28 to the U4/U6.U5 tri-snRNP and therefore for the integration of the tri-snRNP into the spliceosome.
Keywords: hPrp28; Prp28; U5-100K; spliceosome; DEAD-box; DExD/H-box; structure; RS domain
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DEAD-Box Proteine gehören zur Superfamilie der Helikasen. Sie verwenden die Energie aus der ATP-Hydrolyse, um RNA-RNA- oder RNA-Protein-Interaktionen aufzulösen und katalysieren auf diese Weise Konformationsänderungen in Ribonukleoproteinkomplexen. Das DEAD-Box Protein hPrp28 ist Bestandteil des U5 snRNP des humanen Spleißosoms. Es ist notwendig für die Integration des U4/U6.U5 tri-snRNP in diesen makromolekularen Komplex und die anschließend stattfindende Konformationsänderung, die zum aktiven Spleißosom und zur ersten Transester-Reaktion führt. Vermutlich katalysiert hPrp28 dabei an der 5 -Spleißstelle der prä-mRNA den Austausch der U1 snRNA gegen die U6 snRNA. In dieser Arbeit wurde die C-terminale Helikasedomäne von hPrp28 kristallisiert und seine Struktur durch Röntgenbeugungsexperimente bestimmt. Sie umfasst zwei Subdomänen, die jeweils ein zentrales β-Faltblatt enthalten, das von mehreren α-Helices umgeben wird. Dieser Aufbau ist sehr ähnlich zu demjenigen in bekannten Strukturen anderer DEAD-Box Proteine. Unterschiedlich ist aber die relative Orientierung der Subdomänen zueinander. In der erhaltenen Struktur von hPrp28 liegen die Subdomänen in einer sehr offenen Konformation vor. Zur biochemischen Charakterisierung der Helikasedomäne von hPrp28 wurden Interaktionsstudien mit möglichen Liganden duchgeführt. Die Untersuchung der RNA-Bindung mit verschiedenen Substraten weist darauf hin, dass sie möglicherweise mit doppelsträngiger RNA interagiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Helikasedomäne von hPrp28 in vitro ADP bindet, nicht aber ATP. Dementsprechend konnte auch keine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Die Molekularstruktur macht sichtbar, dass die ATP-Bindestelle der Helikasedomäne durch die Konformation der P-Schleife geschlossen ist und darum die Bindung von ATP sterisch inhibiert wird. N-terminal hat hPrp28 eine Arginin-Serin-reiche Domäne. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sie in vitro durch die Kinasen SRPK1 und Clk1 vielfach phosphoryliert werden kann und dass sich die Phosphorylierung durch SRPK1 auf die ersten 125 Aminosäuren konzentriert. In Zusammenarbeit mit Rebecca Mathew und Reinhard Lührmann (MPI, Göttingen) ergab sich, dass diese Phosphorylierung essentiell für die Bindung von hPrp28 an das U4/U6.U5 tri-snRNP ist und damit auch für die Integration des tri-snRNP in das Spleißosom.
Schlagwörter: hPrp28; Prp28; U5-100K; Spleißosom; DEAD-Box; DExD/H-Box; Struktur; RS Domäne
