Kristallstrukturanalyse des spleißosomalen DEAD-Box Proteins hPrp28

Abstract

DEAD-Box Proteine gehören zur Superfamilie der Helikasen. Sie verwenden die Energie aus der ATP-Hydrolyse, um RNA-RNA- oder RNA-Protein-Interaktionen aufzulösen und katalysieren auf diese Weise Konformationsänderungen in Ribonukleoproteinkomplexen. Das DEAD-Box Protein hPrp28 ist Bestandteil des U5 snRNP des humanen Spleißosoms. Es ist notwendig für die Integration des U4/U6.U5 tri-snRNP in diesen makromolekularen Komplex und die anschließend stattfindende Konformationsänderung, die zum aktiven Spleißosom und zur ersten Transester-Reaktion führt. Vermutlich katalysiert hPrp28 dabei an der 5 -Spleißstelle der prä-mRNA den Austausch der U1 snRNA gegen die U6 snRNA. In dieser Arbeit wurde die C-terminale Helikasedomäne von hPrp28 kristallisiert und seine Struktur durch Röntgenbeugungsexperimente bestimmt. Sie umfasst zwei Subdomänen, die jeweils ein zentrales β-Faltblatt enthalten, das von mehreren α-Helices umgeben wird. Dieser Aufbau ist sehr ähnlich zu demjenigen in bekannten Strukturen anderer DEAD-Box Proteine. Unterschiedlich ist aber die relative Orientierung der Subdomänen zueinander. In der erhaltenen Struktur von hPrp28 liegen die Subdomänen in einer sehr offenen Konformation vor. Zur biochemischen Charakterisierung der Helikasedomäne von hPrp28 wurden Interaktionsstudien mit möglichen Liganden duchgeführt. Die Untersuchung der RNA-Bindung mit verschiedenen Substraten weist darauf hin, dass sie möglicherweise mit doppelsträngiger RNA interagiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Helikasedomäne von hPrp28 in vitro ADP bindet, nicht aber ATP. Dementsprechend konnte auch keine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Die Molekularstruktur macht sichtbar, dass die ATP-Bindestelle der Helikasedomäne durch die Konformation der P-Schleife geschlossen ist und darum die Bindung von ATP sterisch inhibiert wird. N-terminal hat hPrp28 eine Arginin-Serin-reiche Domäne. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sie in vitro durch die Kinasen SRPK1 und Clk1 vielfach phosphoryliert werden kann und dass sich die Phosphorylierung durch SRPK1 auf die ersten 125 Aminosäuren konzentriert. In Zusammenarbeit mit Rebecca Mathew und Reinhard Lührmann (MPI, Göttingen) ergab sich, dass diese Phosphorylierung essentiell für die Bindung von hPrp28 an das U4/U6.U5 tri-snRNP ist und damit auch für die Integration des tri-snRNP in das Spleißosom.