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Untersuchung der Stressantwort von Picrophilus torridus mittels 2D-Gelelektrophorese und Charakterisierung ausgewählter Dehydrogenase

Stress response in Picrophilus torridus and characterization of different dehydrogenases

von Andrea Thürmer
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2008-01-23
Erschienen:2008-07-09
Betreuer:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
Gutachter:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
Gutachter:Prof. Dr. Gerhard Gottschalk
crossref-logoZum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-264

 

 

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Name:thuermer.pdf
Size:6.66Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Zusammenfassung

Englisch

The thermoacidophilic archaeon Picrophilus torridus belongs to the Thermoplasmatales and is the most acidophilic microbe yet known. Optimal living conditions are at 60°C and pH 0.7. Some coding genes that may be responsible for survival under these harsh conditions were concluded from analysis of its 1.55 megabase genome. Because of its thermoacidophilic properties this organism potentially offers the opportunities to study the mechanism to thermoacidophilic adaptation and the study of enzymes with biotechnological potential. The goals of these studies were on the one hand the heterologous overexpression and characterization of different P. torridus dehydrogenases and on the other hand to study the stress-response to various pH and temperature-conditions. The glycerol-dehydrogenase was successfully cloned in a maltose-binding-protein fusion construct. It was purified with the help of an amylose gravitation column and a specific activity of 1,92 U/mg at 55°C and pH 5 was determined. Based on quantitative 2D gel electrophoresis a proteome study was performed in order to analyze pH- or temperature-specific adaptation differences in the protein composition under changing growth conditions. Two different temperatures (50°C and 70°C) and two different pH conditions (pH 0,3 and pH 1,8) were used. The cells were incubated for 2 hours under these stress conditions. In the first studies we developed a proteomic map of P. torridus cell lysate grown until the exponential phase. This cytosolic fraction was separated over IPG 4-7 and 3-10, with a second dimensional gel made of 12% polyacrylamid. From a total of 470 spots that were mapped under these conditions, 420 spots were identified and represented 251 different gene products. According to this mastergel, spots that were overexpressed during stress response could be identified. A further experiment compared cells that grew until exponential phase with those, grown in the late stationary phase.
Keywords: Picrophilus torridus; stress response; proteom analysis; archaea; pH-stress; temperature-stress; 2D-gelelectrophoresis; dehydrogenases

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Picrophilus torridus gehört zur Ordnung der Thermoplasmatales und ist der acidophilste Mikroorganismus, der bisher isoliert wurde. Er lebt optimal bei 60°C und pH 0.7. Als thermoacidophiles Archeaon bietet es ein potentielles Modell zur Untersuchung verschiedener Mechanismen, die eine Anpassung an diese extremen Bedingungen möglich machen. Zudem kann P. torridus für die Untersuchung biotechnologisch relevanter Enzyme eingesetzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum einen eine Glycerol-Dehydrogenase, eine Alkohol-Dehydrogenase und zwei verschiedene Glucose-1-Dehydrogenasen in verschiedene Expressionssysteme kloniert, versucht heterolog zu expremieren, aufzureinigen und zu charakterisieren. Zum anderen wurden die pH-Stress- und Temperaturstressantwort in P. torridus mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese untersucht. Im Rahmen der heterologen Expression der ausgewählten Dehydrogenasen konnte die Glycerol-Dehydrogenase erfolgreich in ein Fusionskonstrukt mit einem Maltose-Binde-Protein kloniert werden. Die Aufreinigung erfolgte über eine Amylose-Gravitationssäule mit einer anschließenden spezifischen Aktivitätsbestimmung von 1,92 U/mg bei 55°C und pH 5. Im Rahmen der quantitativen 2D-Gelelektrophorese wurden die pH- und Temperatur-spezifischen Veränderungen als Folge der Anpassung an diese Bedingungen durch die Unterschiede im Expressionsmuster auf einem 2D-Gel untersucht. In einer ersten Studie wurde eine Proteom-Karte von P. torridus unter optimalen Wachstumsbedingungen erstellt. Über einen IPG von 4-7 und 3-10 in der ersten Dimension konnten 470 Proteinspots aufgetrennt werden. Von diesen konnten 420 mittels MS/MS identifiziert werden. Anhand dieses Mastergels wurden die Proteine identifiziert, welche in Folge der Stressantwort auf verschiedene Bedingungen überproduziert waren. Es wurde die Stressantwort nach 2 Stunden Inkubation bei zwei verschiedenen Temperaturen (50°C und 70°C) und zwei verschiedenen pH-Bedingungen (pH 0,3 und pH 1,8) analysiert. Dabei konnten Proteine identifiziert werden, die ubiquitär bei den Stressbedingungen überproduziert werden, aber auch Proteine, die spezifisch als Antwort auf das jeweilige Stressstimulon verstärkt produziert werden.
Schlagwörter: Picrophilus torridus; Stressantwort; Proteomanalysen; Archaea; pH-Stress; Temperatur-Stress; 2D-Gelelektrophorese; Dehydrogenasen
 

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