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Biophysikalische und thermodynamische Charakterisierung der neuronalen SNARE-Komplexbildung

dc.contributor.advisorJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorWiederhold, Katrinde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:51:15Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:29Zde
dc.date.issued2008-07-16de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ACFF-9de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-270
dc.description.abstractMembranfusionsereignisse werden durch eine konservierte Proteinfamilie, die so genannten SNARE-Proteine, vermittelt. SNARE-Proteine bilden einen stabilen α-helikalen Komplex zwischen zwei Membranen aus. Dabei bilden die plasmamembranständigen Proteine SNAP-25 und Syntaxin einen Akzeptorkomplex für das in der Vesikelmembran sitzende Synaptobrevin aus. Man geht davon aus, dass sich aufgrund dieser Komplexbildung die Membranen annähern und so letztendlich deren Fusion induziert wird. Der genaue Ablauf dieser Reaktionen, sowie mögliche Intermediate der Komplexbildung, konnte bisher nicht vollständig aufgeklärt werden. Um zu einem tieferen Verständnis des Ablaufs der SNARE-vermittelten Membranfusion beizutragen, wurden in dieser Arbeit die einzelnen Schritte der SNARE-Komplexbildung in vitro anhand von biophysikalischen Methoden, wie CD- und Fluoreszenzspektroskopie charakterisiert. Zusätzlich wurde die SNARE-Komplexbildung thermodynamisch mittels Isothermaler Titrationskalorimetrie untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde die Interaktion von Syntaxin und SNAP-25 untersucht, die einen Akzeptorkomplex f¨ur Synaptobrevin bilden. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Bildung des Q-SNARE-Akzeptorkomplexes geschwindigkeitsbestimmend für die nachfolgenden Schritte ist. Mittels zielgerichteter Mutationen in SNAP-25 wurde gezeigt, dass die N-terminalen Regionen der drei Q-SNARE-Helices für die Komplexbildung entscheidend sind. Weitere thermodynamische Analysen ergaben, dass die langsame Q-SNARE-Akzeptorbildung möglicherweise in vivo durch einen priming factor beschleunigt wird. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der nachfolgenden Synaptobrevinbindungsreaktion. In diesem Schritt bindet Synaptobrevin an den Q-SNARE- Akzeptorkomplex, jedoch kann in vitro ein zweites Syntaxinmolekül die Bindungsstelle von Syntaxin blockieren. Dieses experimentelle Problem wurde mit der Verwendung eines stabilisierten Akzeptorkomplexes umgangen, bei dem ein C-terminales Synaptobrevinpeptid einen Komplex mit Syntaxin und SNAP-25 bildet. Dieser stabilisierte Akzeptorkomplex bietet eine freie N-terminale Synaptobrevinbindungsstelle und nach der Bindung von Synaptobrevin kann das C-terminale Synaptobrevinfragment aus dem Verbund verdrängt werden. Durch Mutationen sowohl im Bindungsbereich des Akzeptorkomplexes als auch in Synaptobrevin, konnte der Bindungsschritt erstmals in vitro detailiert analysiert werden. Der N-terminale Bereich von Synaptobrevin wurde als essenziell für die ternäre SNARE-Komplexbildung identifiziert. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu anderen Synaptobrevinhomologen, das regulatorische R-SNARE-Protein Tomosyn nicht an die Bindungsstelle für Synaptobrevin im stabilisierten Akzeptorkomplex binden kann. Auch wurde der C-terminale Aufrollschritt, der auf die Synaptobrevinbindung folgt, im dritten Teil dieser Arbeit näher charakterisiert. Dabei konnte CD-spektroskopisch gezeigt werden, dass sich SNARE-Komplexe mit C-terminalen Mutationen in zwei Phasen entfalten. Dies gibt einen strukturellen Hinweis darauf, dass ein C-terminal destabilisierter SNARE-Komplex existieren kann. Anhand von thermodynamischen Untersuchungen wurde außerdem deutlich, dass die C-terminale Faltungsreaktion reversibel sein könnte und demnach nicht die treibende Kraft der Membranfusion sein kann, sondern weitere regulatorische Proteine für diesen Schritt nötig sind.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleBiophysikalische und thermodynamische Charakterisierung der neuronalen SNARE-Komplexbildungde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedBiophysical and Thermodynamical Characterization of the Neuronal SNARE Complex Formationde
dc.contributor.refereeJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.date.examination2008-04-30de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengMembrane fusion events are mediated by a set of conserved protein machinery, the SNARE proteins. SNARE proteins assemble into a very stable α-helical complex between two membranes. The plasma membrane residing SNARE proteins, syntaxin and SNAP-25, form an acceptor complex for the vesicular SNARE protein, synaptobrevin. The formation of the SNARE complex brings the two membranes closer and thus, leads to membrane fusion. The exact process of this reaction and the possible intermediates of complex formation have yet to be described. In order to gain deeper insights into the process of SNARE mediated membrane fusion, I used biophysical methods such as circular dichroism and fluorescence spectroscopy to characterize distinct steps of complex assembly in vitro. Also, I investigated the thermodynamics of the SNARE complex assembly using isothermal titration calorimetry. In the first section, I investigated the interaction of syntaxin and SNAP-25 and their assembly into an acceptor complex for synaptobrevin binding. Previous work has shown that the formation of this Q-SNARE acceptor complex is the rate-limiting step for subsequent steps in SNARE complex formation. Site-directed mutations in SNAP-25 revealed that the N-terminal regions of the Q-SNAREs are critical for the acceptor complex assembly. Further thermodynamic analysis showed that this slow interaction is probably catalyzed in vivo by a priming factor. Next, I investigated the binding of synaptobrevin to the Q-SNARE acceptor complex. In the in vitro setting, a second syntaxin molecule occupies the synaptobrevin bindung site. This technical problem was solved by using a stabilized acceptor complex which consists of SNAP-25, syntaxin and a C-terminal synaptobrevin peptide. This peptide-stabilized acceptor complex provides a free N-terminal binding site for synaptobrevin. Upon synaptobrevin binding, the peptide is displaced and the ternary SNARE complex forms. Using this stabilized complex, I studied the synaptobrevin binding with mutations in the different hydrophobic layers as well as by truncating the single SNARE proteins. The N-terminal region of synaptobrevin proved to be essential in the formation of the ternary SNARE complex. Additionally, contrary to other R-SNARE homologs, the regulatory R-SNARE tomosyn is unable to bind to the synaptobrevin binding site in the stabilized acceptor complex. In the third part, I attempted to study the C-terminal folding of the SNARE complex after binding of synaptobrevin. Thermal melts using circular dichroism revealed that C-terminally mutated SNARE complexes unfold in two phases. Furthermore, based on thermodynamic experiments, it seems that the C-terminal folding step is able to alternate between a folded and unfolded state. This results might indicate the existence of a partially destabilized SNARE complex. Thus, the final assembly step might not provide the driving force for membrane fusion and other regulatory proteins are necessary to fulfill this task.de
dc.contributor.coRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerMembranfusionde
dc.subject.gerSNARE-Proteinede
dc.subject.gerKomplexbildungde
dc.subject.engmembrane fusionde
dc.subject.engSNARE proteinsde
dc.subject.engcomplex assemblyde
dc.subject.bk35.73 Biochemische Reaktionende
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1841-0de
dc.identifier.purlwebdoc-1841de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullSXB 000: Biochemische Reaktionen, Stoffwechselvorgängede
dc.identifier.ppn596070055de


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