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Regulation of nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae: Nitrogen and oxygen signal perception by the negative regulator NifL

dc.contributor.advisorSchmitz-Sreit, Ruth Prof. Dr.de
dc.contributor.authorThummer, Robertde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:51:17Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:29Zde
dc.date.issued2008-08-08de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD03-6de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-274
dc.description.abstractIn dem diazotrophen Organismus Klebsiella pneumoniae wird der nif - spezifische Transkriptionsaktivator NifA als Reaktion auf molekularen Sauerstoff und Ammonium durch NifL gehemmt. Die Komplexbildung zwischen NifL und NifA (etwa 1:1-Verhältnis) erfolgt, wenn die Synthese der beiden Proteine in Gegenwart von Sauerstoff und / oder Ammonium stattfindet. Bei Sauerstoff- und Stickstoff-Abwesenheit hingegen wird eine geringere Menge an NifL/NifA-Komplexen (ca. 1%) im Zytoplasma gebildet, da der Großteil des NifL-Proteins an der Zytoplasmamembran ankonzentriert wird. Dies deutet darauf hin, dass die Inhibierung von NifA in Gegenwart von Sauerstoff und / oder Ammonium über direkte Interaktion mit NifL erfolgt und die Bildung der inhibierenden NifL/NifA-Komplexe ausschließlich von der Lokalisation von NifL im Zytoplasma abhängt. Um einen tieferen Einblick in den Mechanismus der Membranassoziation von reduziertem NifL zu erhalten, wurde untersucht, ob die benötigten Elektronen direkt vom reduzierten Menachinonpool stammen. Durch Verwendung eines künstlichen Membransystems, das gereinigte Komponenten der anaeroben Atmungskette von Wolinella succinogenes enthält, wurde die Reduktion von NifL analysiert. Bei einem in vitro Ansatz, in dem Formiatdehydrogenase und Menachinon oder 8-Methyl-Menachinon aus W. succinogenes enthaltende Proteoliposomen verwendet wurden, wurde die Reduktion von gereinigtem NifL durch Oxidation von Formiat bewerkstelligt und mit UV-vis Spektren beobachtet. Die resultierenden Reduktionsraten, die mit gleichen Mengen an untersuchtem NifL errechnet wurden, zeigten, dass die Reduktion von NifL direkt sowohl von der Menge an in die Liposomen eingebauter Formiatdehydrogenase als auch der Menachinone abhängig ist. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass Elektronen direkt vom Menachinon auf den FAD Cofaktor von NifL transferiert werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass reduziertes NifL stark an die Proteoliposomen assoziiert vorliegt, was früheren in vivo Ergebnissen entspricht. Auf Basis dieser Experimente wird vermutet, dass der Redoxstatus des Menachinonpools das Redoxsignal der nif-Regulation durch den direkten Elektronentransfer auf NifL in K. pneumoniae unter anaeroben Bedingungen darstellt. Um die Aminosäuren zu identifizieren, die entweder für die Membranassoziation von NifL oder die Bindung des Cofaktors essentiell sind, wurde eine zufällige Mutagenese des nifL-Gens durchgeführt, die zu verschiedenen Aminosäure-Substitutionen im transkribierten Protein führt. Insgesamt wurden 11.500 Klone auf deren nif - - Phänotyp unter stickstofffixierenden Bedingungen gescreent, die aus 3 unabhängig erstellten Plasmidpools hergestellt wurden, welche zufällig mutagenisierte nifL-Gene auf einem Plasmid enthielten. Nach unterschiedlichen unabhängigen Wachstumsversuchen mit molekularem Stickstoff als alleiniger Stickstoffquelle konnten 26 Mutanten identifiziert und bestätigt werden, die nicht mehr in der Lage waren Stickstoff zu fixieren, und 41 Mutanten, die eine deutlich reduzierte Stickstofffixierung aufwiesen. Durch Sequenzanalysen wurden Aminosäure-Substitutionen identifiziert, die sich hauptsächlich innerhalb der N-terminalen Domäne befinden, welche für die Interaktion mit der Zytoplasmamembran verantwortlich ist und die den FAD-Cofaktor beinhaltet. Einige der so eingeführten Mutationen wurden ausgewählt und mit Hilfe von gerichteter Mutagenese vereinzelt, um deren Effekte zu klären. Für die Transduktion des Stickstoffsignals auf das nif-Regulationssystem wird das Stickstoff-Sensorprotein GlnK benötigt. Es wurde gefunden, dass GlnK unter stickstofflimitierten Bedingungen mit NifL und NifA trimere Komplexe bildet. Die Bindung von GlnK mit NifL/NifA ist spezifisch, wenngleich die Menge an GlnK innerhalb der Komplexe gering ist. Zwei weitere deutliche Hinweise zeigen, dass unter anaeroben Bedingungen aber in Anwesenheit von Ammonium zusätzliches NtrC-unabhängig synthetisiertes GlnK die Stabilität der inhibitorischen NifL/NifA-Komplexe verringert. Daher wird vorgeschlagen, dass der trimere NifL/NifA/GlnK-Komplex eine vorübergehende Struktur darstellt und es wird vermutet, dass GlnK mit dem inhibitorischen NifL/NifA-Komplex interagiert und dessen Dissoziation bei Stickstofflimitierung verursacht.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleRegulation of nitrogen fixation in <i>Klebsiella pneumoniae</i>: Nitrogen and oxygen signal perception by the negative regulator NifLde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedRegulation der Stickstofffixierung in <i>Klebsiella pneumoniae</i>: Stickstoff- und Sauserstoff-Signalaufnahme durch den negativen Regulator NifLde
dc.contributor.refereeLiebl, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.date.examination2007-10-31de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengIn the diazotroph Klebsiella pneumoniae, the nif specific transcriptional activator NifA is inhibited by the flavoprotein NifL in response to molecular oxygen and ammonium. We demonstrated that complexes between NifL and NifA (approximately 1:1 ratio) are formed, when synthesized in the presence of oxygen and/or ammonium. In contrast, under oxygen- and nitrogen-limitation, significant but fewer NifL/NifA-complexes (approximately 1 %) are found in the cytoplasm because the majority of NifL is sequestered to the cytoplasmic membrane. These findings indicate that inhibition of NifA in the presence of oxygen and/or ammonium occurs via direct NifL interaction and formation of those inhibitory NifL/NifA-complexes appears to be directly and exclusively dependent on the localization of NifL in the cytoplasm. To get deeper insights into the mechanism of sequestration of the reduced regulator NifL to the cytoplasmic membrane we analyzed whether the electrons required directly derived from the reduced menaquinone pool. By using an artificial membrane system containing purified components of the anaerobic respiratory chain of Wolinella succinogenes the reduction of NifL was studied. In an in vitro assay using proteoliposomes containing purified formate dehydrogenase and purified menaquinone (MK6) or 8-methyl-menaquinone (MMK6) from W. succinogenes, reduction of purified NifL was achieved by formate oxidation and monitored using UV-vis spectra. The resulting reduction rates, which were determined using equal amounts of NifL, elucidated that reduction of NifL is directly dependent on both, formate dehydrogenase and menaquinones incorporated into the liposomes. These findings strongly indicate that electrons are directly transferred from menaquinones to the FAD cofactor of NifL. Further we demonstrated that reduced NifL was found to be highly associated to the proteoliposomes, which is in accordance to previous findings in vivo. On the basis of these experiments we propose that the redox state of the menaquinone pool is the redox signal for nif-regulation in K. pneumoniae by directly transferring electrons onto NifL under anaerobic conditions. In order to discover amino acids which are essential for membrane association or FAD binding of NifL we performed a random mutagenesis of the nifL-gene yielding amino acid substitutions in the regulatory protein NifL. Overall, 11.500 clones out of three independently generated pools carrying plasmids containing randomly mutated nifL-genes were screened for mutants conferring a nif - - phenotype under nitrogen fixing conditions. After several independent growth experiments with molecular nitrogen as sole nitrogen source we identified and confirmed 26 mutants showing no nitrogen fixation at all and 41 mutants showing significantly reduced nitrogen fixation. By sequence analyses we identified amino acid substitutions located mainly within the N-terminal domain, which is considered to interact with the cytoplasmic membrane and which contains the FAD cofactor, and selected parts of these mutations for separation by site directed mutagenesis to clarify their functions. For the transduction of the nitrogen signal to the nif-regulatory system the nitrogen sensory protein GlnK is required. We observed evidence that GlnK forms trimeric complexes with NifL and NifA under nitrogen limitation. The binding of GlnK to NifL/NifA was specific, however, the amount of GlnK within these complexes was small. Finally, two lines of evidence were obtained that under anaerobic conditions but in the presence of ammonium additional NtrC-independent GlnK synthesis inhibited the formation of stable inhibitory NifL/NifA-complexes. Thus, we propose that the NifL/NifA/GlnK-complex reflects a transitional structure and hypothesize that under nitrogen-limitation, GlnK interacts with the inhibitory NifL/NifA-complex, resulting in its dissociation.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerStickstofffixierungde
dc.subject.gerRegulationde
dc.subject.gerSignalaufnahmede
dc.subject.gerNifLde
dc.subject.gerNifAde
dc.subject.gerGlnKde
dc.subject.engnitrogen fixationde
dc.subject.engregulationde
dc.subject.engsignal perceptionde
dc.subject.engNifLde
dc.subject.engNifAde
dc.subject.engGlnKde
dc.subject.bk42.30de
dc.subject.bk42.13de
dc.subject.bk35.70de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1863-2de
dc.identifier.purlwebdoc-1863de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWU 000: Mikrobiologiede
dc.subject.gokfullWUK 000: Genetik der Mikroorganismen, Molekularbiologie der Mikrorganismen {Mikrobiologie}de
dc.subject.gokfullWUE 000: Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen {Mikrobiologie}de
dc.identifier.ppn644986956de


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