Submembrane cytoskeleton-regulated assembly and functional activity of gap junctions

Abstract

Connexine formen gap junctions, die den Transfer von Ionen, Metaboliten und second messengers zwischen sich berührenden Zellen vermitteln. An vielen Funktionen der Connexine, z.B. zellulärer Transport, Plaquebildung und -stabilität sowie Kanalleitfähigkeit sind Proteine beteiligt, die an die cytoplasmatischen Domänen von Connexinen binden. Jedoch ist auch jetzt noch wenig bekannt über diese regulatorischen Proteine.In der vorliegenden Arbeit wurden neue Proteine, die am intrazellulären Transport von Connexin 43 und an der Festlegung der funktionalen Aktivität von Gap junctions unter der Plasmamembran beteiligt sind, identifiziert.Das Auftreten von Connexin43 (Cx43) in der Plasmamembran hängt von der funktionellen Aktivität der kleinen GTPasen Sar1 und ARF1 ab. Der Transport von Cx43 vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat wurde durch die Expression einer GTP-restrikten Mutante des Sar1 blockiert. Die GTP-gebundene Mutante der ARF1 verhinderte den Transport des Cx43 vom Golgi-Apparat zur Plasmamembran.Drebrin, ein Actin-bindendes Protein, wurde durch einen proteomischen Ansatz als ein Partner von Cx43 identifiziert, der mit dessen terminalen COOH-Domäne interagiert. Die Drebrin-Cx43 Interaktion, in vorliegender Arbeit erstmals beschrieben, wurde durch die Kolokalisation beider endogener Proteine in Astrozyten und in Vero Zellen, mit immunopräzipitiven, elektromikroskopischen und elektrophysiologischen Untersuchungen, sowie mit Expressionsansätzen beider Proteine mit fluoreszierenden Tags" und mit FRET Analysen in lebenden Zellen bestätigt. Eine Depletion von Drebrin in Zellen mit si-RNA resultierte in einer Beeinträchtigung der Farbkopplung und der elektrischen Kopplung von Zellen mit gap junctions, in einer Internalisierung von gap junctions und des Abbaus von Cx43.Auf der Basis dieser Daten schlussfolgere ich, dass Drebrin erforderlich ist, um die Cx43-enthaltenden gap junctions in der Plasmamembran in ihrem funktionellen Zustand aufrechtzuerhalten. Es ist deshalb möglich, dass Drebrin mit gap junctions im Bereich der Zellkontakte in regulatorischer Weise auf extrazelluläre Signal interagiert. Die Neuordnung oder Störung der Interaktion zwischen Connexin43 und dem Drebrin-enthaltenden Sub-membranale-Zytoskelett weist Connexin43 auf zelluläre Abbauwege hin.