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Biophysical Characterization of SNARE Complex Disassembly Catalyzed by NSF and alphaSNAP

dc.contributor.advisorFasshauer, Dirk Prof. Dr.de
dc.contributor.authorWinter, Ulrikede
dc.date.accessioned2012-04-16T14:51:25Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:32Zde
dc.date.issued2008-09-17de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD0B-5de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-282
dc.description.abstractFuer die Fusion intrazellulaerer biologischer Membranen sind Vertreter der konservierten Familie der SNARE-Proteine von essentieller Bedeutung. Man vermutet, dass gerichtete Komplexbildung zwischen SNAREs auf gegenueberliegenden Membranen dazu fuehrt, dass die zu fusionierenden Mebranen in raeumliche Naehe gezogen werden und schliesslich verschmelzen. SNARE-Komplexe bilden sich spontan, wenn die einzelnen SNARE-Komponenten in Loesung vermengt werden und sind aeusserst stabil. Es muss daher Energie aufgewendet werden, um die SNARE-Komplexe nach der Membranfusion wieder in ihre Einzelteile zu dissoziieren um damit die einzelnen SNAREs fuer weitere Fusionsereignisse zur Verfuegung zu stellen. Deshalb wird die Dissoziierung der SNARE-Komplexe durch ein Enzym, die AAA ATPase NSF sowie ihren Kofaktor SNAP vermittelt. Dazu binden vermutlich drei SNAP-Molekuele einen SNARE-Komplex und bilden so ein Podest, das als Angriffsstelle fuer das hexamere, ringfoermige NSF dient.Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Grundlagen der SNARE-Komplex- Dissoziierung inklusive verschiedener SNAP-Isoformen und moeglicher regulatorischer Faktoren, sowie den Grad der funktionellen Koservierung zu untersuchen. Hierzu wurden zwei fluoreszenzbasierte in vitro Methoden (FRET und Fluoreszenz- Anisotropy) zur direkten Messung des SNARE-Komplex Dissoziation durch NSF und alphaSNAP etabliert. Waehrend der Charakterisierung der Reaktion zeigte sich, dass das verwendete rekombinante alphaSNAP deutlich effizienter auf einer Plasmamembranpraeparation "ex vivo" als in den in vitro FRET- und Anisotropie-Ansaetzen agierte. Es reichte aus, die rekombinanten SNARE-Komplexe vor der Reaktion in Liposomen zu inkorporieren, um die beobachtete Diskrepanz zwischen der ex vivo- und der in vitro-Praeparation zu eliminieren. Dieses deutet darauf hin, dass Lipidmembranen die Faehigkeit von alphaSNAP, im Verbund mit NSF SNARE-Komplexe zu dissoziieren, erhoehen.Weiter konnte ich den Unterschied zwischen der Effizienz des alphaSNAPs in Loesung und auf Liposomen aufheben, indem ich eine N-terminale Deletion des alphaSNAP-Proteins vornahm. Dieser Befund laesst darauf schliessen, dass die N-terminale Interaktion von alphaSNAP mit der Membran die Effektivitaet von alphaSNAP waehrend der SNARE-Komplex-Dissoziation steigert. Zusaetzlich zu dem membrangebundenen SNARE-Komplex scheint die Membran selbst demnach als zweiter, kooperativer SNAP-Bindungspartner zu fungieren. Zudem konnte ich zeigen, dass die Verstaerkung der SNAP-Effizienz in Gegenwart von Membranen auch fuer die Isoform betaSNAP und das Hefe-Homolog Sec17 konserviert ist. Ausserdem habe ich mithilfe verschiedener Mutanten und Inhibitoren moegliche regulatorische Angriffspunkte charakterisiert. Ein Antikoerper gegen die N-terminal Domaene von NSF, der auch im Rahmen dieser Arbeit hergestellt wurde, vermochte die Dissoziationsreaktion komplett zu blockieren und koennte zukuenftig fuer in vivo- Experimente eingesetzt werden. Drei Antikoerper gegen den SNARE-Komplex hemmten die Dissoziationsreaktion teilweise, aber eine komplette Inhibition gelang nur, wenn zwei Antikoerper gemeinsam eingesetzt wurden, einer gegen den N-Terminus und der andere gegen den C-Terminus von alphaSNAP. Analog dazu blockierten SNARE-Komplex- Mutanten die Dissoziationsreaktion nur, wenn zwei entfernte Positionen mutiert worden waren. All dies laesst darauf schliessen, dass die Reaktion sehr robust ist.Das SNARE-Komplex-bindende Protein Complexin1 inhibierte die Reaktion in Abhaengigkeit von der alphaSNAP-Konzentration. Die Ergebnisse zeigen, dass Complexin und alphaSNAP unter in vitro-Bedingungen miteinander um die SNARE-Komplex- Bindung konkurrieren. Der inhibitorische Effekt von Complexin war in Loesung staerker als auf Liposomen, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Affinitaet von Complexin zum SNARE-Komplex sich in Gegenwart von Membranen nicht im selben Ausmass steigert wie die von alphaSNAP. Schliesslich konnte ich zeigte, dass beide Protein-Schnittstellen zwischen Substrat, Adaptor und Enzym zwischen Hefen und Saeugern stark genug konserviert sind um den Austausch einzelner Komponenten zu ermoeglichen, ohne dass die Reaktion zum Erliegen kommt. Dabei fuehrt der Austausch des Adaptors zu einem weitaus staerkeren Defekt als der Austausch des Enzyms oder des Komplexes. Offenbar wird die Reaktion demnach nur dann schwer gestoert, wenn sich an beiden Schnittstellen Proteine aus verschiedenen Organismen treffen.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleBiophysical Characterization of SNARE Complex Disassembly Catalyzed by NSF and alphaSNAPde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.date.examination2008-07-03de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengSNAREs (SNAP receptors) are small membrane-bound proteins which are key mediators of intracellular membrane fusion. The actual fusion step is believed to occur through complex formation of SNAREs sitting on opposing membranes, first bringing the membranes into close apposition and finally enabling them to fuse. SNARE complex spontaneously form upon mixing of the single SNAREs in solution and are extremely stable. After membrane merger, the complexed SNAREs need to be dissociated and recycled again to allow for further rounds of fusion. Since the dissociation of SNARE complexes requires energy, this so-called SNARE disassembly is mediated by an enzyme, the AAA ATPase NSF (N-ethyl maleimide sensitive fusion protein) and its cofactor, SNAP. Presumably three SNAPs bind to one SNARE complex to form a binding site for the hexameric NSF. This then binds to the SNAPs and catalyzes the reaction via hydrolysis of ATP.The aim of this study was to investigate the molecular basis of SNARE disassembly including SNAP isoforms, putative regulatory factors and the degree of functional conservation. To this end, I established two fluorescence assays (based on FRET and fluorescence anisotropy) which allow for monitoring of the disassembly reaction in vitro. During the characterization of the disassembly reaction, it soon became evident that the recombinant alphaSNAP performed far less efficient when disassembling soluble SNARE complexes using these methods, than it did during disassembly of `ex vivo" SNARE complexes using so-called plasma membrane sheets. The use of liposome-incorporated SNARE complex for disassembly sufficed to anihilate the observed discrepancy between the ex vivo and the in vitro preparation, indicating that the lipid membrane increases the potency of alphaSNAP during SNARE complex disassembly. I could further demonstrate, that an N-terminal deletion in the alphaSNAP molecule abolishes the membrane caused potentiation of efficacy observed for alphaSNAP. This finding suggests, that the N-terminus of alphaSNAP interacts with the membrane to increase the affinity or effectivity of alphaSNAP during disassembly. In addition to the long established interaction between alphaSNAP and the membrane-bound SNARE complex, the membrane thus serves as a second SNAP receptor which increases alphaSNAP efficiency. Additionaly I demonstrated that the potentiation of SNAP efficiency in the presence of membranes is conserved in the mammalian SNAP isoform betaSNAP and in yeast.Furthermore I performed disassembly reactions using different conditions, mutations and putative inhibitory proteins in order to gain molecular insights into the protein/protein interactions involved and putative regulatory mechanisms of SNARE disassembly. An antibody against the NSF N-terminal domain raised in the scope of this study eliminated SNARE disassembly completely and might serve as a useful tool to specifically block NSF action in in vivo experiments in the future. Three anti SNARE complex antibodies blocked disassembly to a certain extent but a complete block was possible only when two antibodies, one recognizing the N-terminal end and the other recognizing the C-terminal end, were used in concert. Similarly, other SNARE complex mutants only abrogated SNARE disassembly when two alterations were introduced at non-proximal sites. These data indicate that the disassembly process is very robust and the disassembly machinery does not have a preference for either end of the complex.The SNARE-complex interacting protein Complexin1 significantly inhibited SNAREcomplex disassembly in the fluorescence assays in an alphaSNAP concentration-dependent manner. This indicates that Complexin and alphaSNAP compete with each other for SNARE complex binding under in vitro conditions. The inhibition of disassembly by Complexin was more pronounced in solution than on liposomes, suggesting that Complexin affinity to the SNARE complex in the presence of membranes is not increased to the same extent as witnessed for alphaSNAP. A phosphorylation mutant of NSF, which has previously been suggested to have a reduced affinity for alphaSNAP, could not be definitely shown to exert a significant defect with regard to the disassembly reaction.I further showed, that between yeast and mammals, both of the protein interfaces between target, adapter and enzyme seem to be conserved well enough to allow proteins of the respective other organism to mediate disassembly. Notwithstanding the fact that disassembly occurs even with exchanged machineries, the kinetics of disassembly may be slightly impeded by two non-cognate proteins at any of the interaction interfaces, whereas they are strongly hampered when both interactions are mediated by non-cognate proteins. Additionally, the high alphaSNAP efficiency on membranes described earlier is independent of the nature of the SNARE target and the membrane boost conserved for the yeast adapter protein Sec17.de
dc.contributor.coRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.geralphaSNAPde
dc.subject.gerNSFde
dc.subject.gerSNARE-Proteinede
dc.subject.gerMembranfusionde
dc.subject.gerSNARE-recyclingde
dc.subject.gerAAA-ATPasende
dc.subject.engalphaSNAPde
dc.subject.engNSFde
dc.subject.engSNARE-Proteinsde
dc.subject.engmembrane fusionde
dc.subject.engSNARE-recyclingde
dc.subject.engAAA-ATPasesde
dc.subject.bk42.12 Biophysikde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1891-1de
dc.identifier.purlwebdoc-1891de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWCde
dc.identifier.ppn596070306de


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