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Electron microscopic localization of tagged proteins in the yeast S. cerevisiae spliceosomal U4/U6.U5 trisnRNP

dc.contributor.advisorLührmann, Reinhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorHäcker, Irinade
dc.date.accessioned2012-04-16T14:51:30Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:29Zde
dc.date.issued2008-10-30de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD0F-Ede
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-286
dc.description.abstractDas Spleißen der prä-mRNA wird von einer makromolekularen Maschine, dem Spleißosom katalysiert. Das Spleißosom wird schrittweise aus den kleinen nukleären Ribonukleoprotein-Partikeln, den sogenannten U1, U2, U5 und U4/U6 snRNPs sowie zahlreichen nicht-snRNP Spleißfaktoren assembliert. Die snRNPs bestehen aus einem RNA-Molekül (bzw. zwei weitgehend basengepaarten RNAs im Fall von U4/U6) und mehreren Proteinkomponenten. Die Assemblierung des Spleißosoms beginnt mit der Bildung des Prä-Spleißosoms (Komplex A) durch die Interaktion des U1 snRNPs mit der 5 Spleißstelle und des U2 snRNPs mit dem Verzweigungspunkt. Die Integration von U5 und U4/U6 in Form eines U4/U6.U5 tri-snRNPs schließt die Assemblierung des Spleißosoms ab (prä-katalytisches Spleißosom oder Komplex B). Der tri-snRNP ist ein wichtiger und evolutionär stark konservierter Baustein des Spleißosoms. Einige der mindestens 28 Proteine des tri-snRNPs aus der Hefe S. cerevisiae spielen eine wichtige Rolle beim Spleißen der prä-mRNA. Während der katalytischen Aktivierung des Spleißosoms wird das komplizierte Netzwerk der Protein-Protein-, Protein-RNA- und RNA-RNA-Interaktionen des tri-snRNPs stark verändert. Ein erster wichtiger Schritt der Aktivierung ist die Entwindung der U4/U6 snRNAs. Nur so kann dann die U6 snRNA mit der 5 Spleißstelle der prä-mRNA und mit der U2 snRNA interagieren, wodurch ein Teil des katalytischen Zentrums des Spleißosoms gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass die U5-spezifischen Proteine Prp8p, die ATPase Brr2p und die GTPase Snu114p direkt an der Entwindung der U4/U6 snRNAs beteiligt sind, und dass dieser Prozess einer strengen Kontrolle unterliegen muss. Es ist jedoch nur wenig bekannt über die Struktur des Hefe tri-snRNPs und seinen molekularen Aufbau. Deshalb haben wir die strukturellen Details des Hefe tri-snRNPs mittels Elektronenmikroskopie untersucht und verschiedene funktionell wichtige U5-, U4/U6- und tri snRNP-spezifische Proteine in ihrer zweidimensionalen Verteilung lokalisiert. Dazu verwendeten wir zwei verschiedene Markierungs-Methoden: (i) Antikörper-Markierung und (ii) genetische Markierung mit einem globulären Protein (54 kDa), das unter dem Elektronenmikroskop direkt sichtbar war. Mit Hilfe dieser beiden Methoden konnten wir die C terminalen Bereiche von sieben Proteinen eindeutig innerhalb der nativen Struktur des tri snRNPs lokalisieren und die Untereinheiten des Komplexes identifizieren. Brr2p wurde in der kopf-ähnlichen Struktur, die C Termini von Prp8p und Snu114p wurden dagegen im zentralen Bereich des Hauptkörpers lokalisiert, welcher daher wahrscheinlich das U5 snRNP enthält. Eine kleinere Arm-Domäne ist über ein Gelenk mit dem zentralen Teil des Hauptkörpers verbunden. In diesem Arm befinden sich die U4/U6 Proteine Prp3p und Lsm8p, woraus wir schließen, dass der Arm das U4/U6 snRNP enthält. Im Gelenk wurden Prp6p und Prp31p lokalisiert, die wahrscheinlich die Interaktion von U5 mit U4/U6 vermitteln. Durch die Kombination von in vivo Markierungs-Methoden und Elektronenmikroskopie ermöglichen wir erstmalig wichtige Einblicke in die detaillierte strukturelle Organisation des tri-snRNPs aus der Hefe. Darüber hinaus lassen diese Daten Schlüsse auf mögliche Interaktionen der tri-snRNP Proteine zu, die zur Entwindung der U4/U6 snRNA führen.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleElectron microscopic localization of tagged proteins in the yeast S. cerevisiae spliceosomal U4/U6.U5 trisnRNPde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedElektronenmikroskopische Lokalisierung markierter Proteine im spleißosomalen U4/U6.U5 tri-snRNP aus der Hefe S. cerevisaede
dc.contributor.refereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.date.examination2008-07-02de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengPre-mRNA splicing is catalyzed by a macromolecular machine called spliceosome . The spliceosome is assembled in a stepwise manner from the small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs), namely U1, U2, U5 and U4/U6, and numerous non-snRNP splicing factors. The snRNPs contain one RNA molecule (or two extensively base-paired RNAs in the case of U4/U6) and several protein components. Spliceosome assembly is initiated by the association of U1 and U2 with the 5´ splice site and the branch point, respectively, forming the pre-spliceosome (complex A). Then U5 and U4/U6 join the spliceosome as a preformed U4/U6.U5 tri snRNP to form the fully assembled pre-catalytic spliceosome (complex B). The tri-snRNP is an important and evolutionarily highly conserved component of the spliceosome. In S. cerevisiae the tri snRNP contains at least 28 proteins, several of which play important roles in pre-mRNA splicing. During catalytic activation of the spliceosome the intricate network of protein-protein, protein-RNA, and RNA-RNA interactions of the tri-snRNP is extensively remodeled. One crucial step of spliceosome activation is the U4/U6 snRNA unwinding, which sets free the U6 snRNA to interact with the 5´ splice site of the pre-mRNA as well as with the U2 snRNA to form part of the catalytic core of the spliceosome. It is well established that the U5-specific proteins Prp8p, the ATPase Brr2p, and the GTPase Snu114p are directly involved in the unwinding of the U4/U6 snRNA duplex and that this process has to be tightly controlled. However, little is known about the overall structure of the yeast tri snRNP and its molecular organization. We therefore used electron microscopy to investigate the structural details of the yeast tri snRNP and to locate a number of its functionally important U5-, U4/U6-, and tri snRNP-specific proteins in two dimensions. To achieve this goal, we applied two independent labeling techniques: (i) immunolabeling and (ii) genetic labeling with a 54 kDa globular protein tag, which was directly visualized in the electron microscope. Together, these approaches allowed us to reliably localize the C-termini of seven targeted proteins within the triangular structure of the native yeast tri-snRNP and to identify the subunits of the particle. In the head -like structure of the tri-snRNP s main body we localized Brr2p, while the C termini of Prp8p and Snu114p are located in the central region of the main body, suggesting that the main body harbors the U5 snRNP. A smaller arm domain is connected to the central region of the main body through a linker. The arm contains the U4/U6 proteins Prp3p and Lsm8p. We therefore conclude that the arm represents the U4/U6 di-snRNP. In the linker region we localized Prp6p and Prp31p, which have been suggested to function as bridging proteins between U5 and U4/U6. By combining in vivo tagging with electron microscopy we provide for the first time important insights into the detailed structural organization of the yeast tri-snRNP. Moreover, the data have several implications for the interactions between tri snRNP proteins which lead to the unwinding of U4/U6 snRNA.de
dc.contributor.coRefereeWimmer, Ernst A. Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeWienands, Jürgen Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerPrä-mRNA Spleissende
dc.subject.gerU4/U6.U5 tri-snRNPde
dc.subject.gerElektronenmikroskopiede
dc.subject.gerS. cerevisiaede
dc.subject.engpre-mRNA splicingde
dc.subject.engU4/U6.U5 tri-snRNPde
dc.subject.engElectron Microscopyde
dc.subject.engS. cerevisiaede
dc.subject.bk35.70 Biochemie: Allgemeinesde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1922-5de
dc.identifier.purlwebdoc-1922de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWA310de
dc.identifier.ppn596076002de


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