Charakterisierung der Eaf 1-Funktion für die Biogenese der Aminopeptidase 1

Abstract

In Saccharomyces cerevisiae wird die Leucin-Exopeptidase Aminopeptidase 1 (Ape1) als Vorläuferform im Zytoplasma synthetisiert, zu Homododecameren oligomerisiert, anschließend über den Cvt-Transportweg in die Vakuole transportiert und dort prozessiert. Die Isolierung und Charakterisierung zweier Mutanten via10 und via14 (vacuole import and autophagocytosis) mit reduzierter, bzw. keiner Ape1-Aktivität, sollte weitere Details über die Biogenese des Proteins liefern. Mittels einer Komplementationsstudie wurde der ORF YDR359C identifiziert, der zum einen die Ape1-Aktivität in dem Mutantenstamm via14 wiederherstellte, und zum anderen nach dessen Deletion zu einem kompletten Verlust dieser führte. YDR359C kodiert für das verifizierte Protein Eaf1 (Esa1-associated factor) und ist neben der katalytischen Untereinheit Esa1 Bestandteil des aus dreizehn Proteinen zusammengesetzten Histon-Acetyltransferase-Komplexes NuA4. Hier konnte gezeigt werden, dass die Expression von Eaf1 die Transkription, Expression und Aktivität der Ape1 erhöht und somit direkt beeinflusst. Interessanterweise ist dies nicht ausschließlich auf einen transkriptionellen Effekt zurückzuführen, da ein induzierter Anstieg der Ape1-Expression alleine nicht im selben Maße zur Restauration der Aktivität führte. Die Deletion weiterer nicht-essentieller Untereinheiten des NuA4-Komplexes hatte ebenfalls keinen, bzw. nur minimalen Einfluss auf die Ape1-Aktivität. Des Weiteren konnte die Ape1-Aktivität sowohl durch amino- als auch carboxyterminal verkürzte Fragmente von Eaf1 wiederhergestellt werden. In in situ Immunfluoreszenzen konnte zwar eine Co-Lokalisation von Eaf1 und Ape1, bis jetzt jedoch keine direkte Interaktion der beiden Proteine gezeigt werden, was vermuten ließe, dass Eaf1 die Ape1-Aktivität unter Umständen nicht direkt, sondern in komplexgebundener Form beeinflusst. Der Verlust des EAF1-Gens beeinträchtigt weder die Prozessierung, noch die Komplexassemblierung der Ape1. Unsere Daten deuten daher auf eine neue Funktion des Proteins Eaf1, u.U. unter Beteiligung anderer Komponenten des NuA4- Komplexes oder durch Interaktion mit noch nicht identifizierten Bindungspartnern hin. Zukünftige Experimente werden dazu beitragen, den Mechanismus der Eaf1-abhängigen Biogenese der Aminopeptidase 1 aufzuklären.