Die parasitophore Vakuole des Mikrosporidiums Encephalitozoon cuniculi: Biogenese und Metabolitaustausch
The parasitophorous vacuole of the microsporidian Encephalitozoon cuniculi: Biogenesis and metabolite exchange
by Karin Rönnebäumer
Date of Examination:2008-10-30
Date of issue:2008-11-12
Advisor:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Microsporidia possess a unique invasion mechanism, which is based on the explosive extrusion of a hollow tube, the so called polar tube, from the microsporidian spore. The common infection model postulates that during extrusion the polar tube pierces the plasma membrane of an adjacent host cell and the infectious sporoplasma is susequently injected through the polar tube into the cytosol of the host cell. After invasion, microsporidia of the genus Encephalitozoon are very quickly surrounded by a parasitophorous vacuole membrane (PVM). Due to the special invasion mechanism of microsporidia and the absence of host cell marker proteins in the PVM directly after invasion (Fasshauer et al., 2005), it was unclear up to now, if the PVM is transferred with the sporoplasm and therefore derived from the microsporidium itself, or if the PVM is derived from the host cell. In this work, a selective labelling of either E. cuniculi membranes or the host cell plasma membrane was used to investigate microsporidia and host cell participation on PVM biogenesis. When E. cuniculi membranes were labelled with the fluorescent lipid BODIPY-500/510-C12-phosphocholine and the labelled spores were used to infect host cells, the fluorescent signal was only detected in the emerging meronts but not in the parasitophorous vacuole membrane. Therefore, E. cuniculi membranes do not significantly participate in the biogenesis of the PVM. In contrast, if the host cell plasma membrane was labelled with the raft and nonraft specific lipids DiIC16 and SPEEDY DiO, both tracers were detectable in the nascent vacuole membrane shortly after invasion. The lipids for the PVM thus originate from the host cell and raft as well as nonraft lipids participate in the biogenesis. To understand the chronology of PVM biogenesis, the invasion of E. cuniculi into living fluorescently labelled host cells was analysed by time lapse microscopy. When a polar tube striked a cell, a fluorescently labelled plasma membrane invagination emerged at the contact site shortly before PVM formation. This observation suggests a modification for the invasion mode of E. cuniculi. According to the new model, the plasma membrane is not pierced but forced to form a long channel-like invagination. Afterwards, the sporoplasm is not injected into the cytosol but into this invagination, followed by parasitophorous vacuole formation from plasma membrane material. Previous colocalization studies showed that the PVM is devoid of the transferrin receptor, a marker for early endosomes and the cell surface (Fasshauer et al., 2005). Since our investigations reveal that the PVM originates from the host cell plasma membrane, the absence or presence of other host cell surface proteins in the PVM was analyzed. A biotinylation of host cell surface proteins and subsequent infection with E. cuniculi showed that host cell surface proteins are absent from the majority (>90%) of the emerging vacuoles. It is likely that during PVM formation or in the first minutes after invasion an exclusion mechamism for host cell surface proteins exists. Exclusion of host cell proteins from the PVM in E. cuniculi is as in Toxoplasma gondii most likely responsible for the fusion incompetence with endosomes and lysosomes, since the PVM lacks proteins necessary for membrane fusion. The genome of E. cuniculi is with ~ 2.9 million basepairs one of the smallest eucaryotic genomes known so far. Due to adaptation to the intracellular lifestyle, E. cuniculi lacks many biosynthetic pathways, for instance amino acid biosynthesis (Katinka et al., 2001). This suggests that E. cuniculi is metabolically extremely dependent on its host cell. Nutrients initially have to pass the parasitophorous vacuole membrane to become available for E. cuniculi. Microinjection of different membrane impermeable dextran dyes and fluorescently labelled peptides into the cytosol of infected host cells revealed that the PVM possesses pores with an exclusion size of 3-10 kDa. The PVM should therefore be permeable to nutrients like carbohydrates, amino acids and ATP. The PVM permeability properties are independent of age or size of the vacuole. During intracellular development, E. cuniculi has thus permanent access to the host cell nutrient pool.
Keywords: microsporidia; Encephalitozoon cuniculi; parasitophorous vacuole
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Mikrosporidien besitzen einen einzigartigen Invasionsmechanismus, bei dem ein so genannter Polartubulus explosionsartig aus der Mikrosporidien-Spore geschleudert wird. Das bisherige Infektionsmodell postuliert, dass der Polartubulus beim Herausschleudern die Plasmamembran einer benachbarten Wirtszelle durchschlägt und das infektiöse Sporoplasma durch den schlauchartigen Polartubulus direkt in das Cytosol der Wirtszelle injiziert wird. Mikrosporidien der Gattung Encephalitozoon sind sehr schnell nach der Invasion von einer parasitophoren Vakuolenmembran (PVM) umgeben. Aufgrund des ungewöhnlichen Invasionsmechanismus von Mikrosporidien und der Abwesenheit von Wirtszell-Markerproteinen in der PVM von Encephalitozoon cuniculi direkt nach der Invasion (Fasshauer et al., 2005) war es bisher unklar, ob die PVM mit dem Sporoplasma übertragen wird, und somit vom Mikrosporidium selbst stammt, oder aber von der Wirtszelle gebildet wird. In dieser Arbeit wurde eine selektive Fluoreszenzmarkierung von entweder E. cuniculi-Membranen oder Wirtszell-Plasmamembran genutzt, um die Beteiligung von Mikrosporidium und Wirtszelle an der Biogenese der PVM zu untersuchen. Wurden E.cuniculi-Membranen mit dem fluoreszierenden Lipid BODIPY-500/510-C12-Phosphocholine markiert, und die markierten Sporen für die Infektion von Wirtszellen verwendet, so war das Fluoreszenzsignal nur in den entstandenen Meronten, nicht aber in der parasitophoren Vakuolenmembran zu finden. E. cuniculi-Membranen tragen somit nicht signifikant zur Bildung der PVM bei. Wurde allerdings die Wirtszell-Plasmamembran mit den raft- und nonraft-spezifischen Lipiden DiIC16 und SPEEDY DiO markiert, so waren beide Farbstoffe sehr schnell nach der Infektion in den entstandenen Vakuolenmembranen nachweisbar. Die Lipide für die Bildung der PVM stammen somit von der Wirtszelle, wobei sowohl raft- als auch nonraft-Lipide zur Biogenese beitragen. Um den zeitlichen Ablauf der PVM-Biogenese zu verfolgen, wurde die Invasion von E. cuniculi in lebenden, Fluoreszenz-markierten Wirtszellen mittels time-lapse -Mikroskopie untersucht. Trifft ein polares Filament eine Wirtszelle, entsteht an der Kontaktstelle kurze Zeit vor der Entstehung der parasitophoren Vakuole eine Fluoreszenz-markierte Invagination der Plasmamembran. Diese Beobachtung deutet auf eine Modifikation des bisherigen Invasionsmodells für E. cuniculi hin. Diesem neuen Modell zufolge wird die Plasmamembran nicht durchschlagen, sondern vom Polartubulus eingedrückt, so dass eine lange Kanalähnliche Invagination entsteht. Das Sporoplasma wird dann nicht in das Cytosol, sondern in diese Invagination injiziert, so dass die parasitophore Vakuole aus Plasmamembran-Material entsteht. In früheren Kolokalisationsstudien wurde gezeigt, dass die PVM den humanen Transferrin-Rezeptor, der als Markerprotein für Wirtszell-Oberflächenproteine gilt, nicht enthält (Fasshauer et al., 2005). Da in dieser Arbeit nachgewiesen wurde dass die PVM aus der Wirtszell-Plasmamembran entsteht, wurde im Folgenden überprüft, ob auch andere Wirtszell-Oberflächenproteine auf der PVM fehlen. Eine Biotinylierung der Wirtszell-Oberflächenproteine, gefolgt von einer Infektion mit E. cuniculi zeigte, dass in der überwiegenden Anzahl (> 90 %) der entstandenen Vakuolen keine Wirtszell-Oberflächenproteine nachweisbar waren. Es scheint somit ein Mechanismus zu existieren, der Wirtszell-Oberflächenproteine entweder während der Entstehung der parasitophoren Vakuole oder aber in den ersten Minuten nach der Invasion aussortiert. Der Ausschluss von Wirtszellproteinen von der PVM ist bei E. cuniculi wahrscheinlich ähnlich wie bei Toxoplasma gondii für die Fusions-Inkompetenz der Vakuole mit Endosomen und Lysosomen verantwortlich, da die für die Membranfusion notwendigen Proteine in der PVM fehlen. Das Genom von E. cuniculi gehört mit einer Größe von ca. 2,9 Millionen Basenpaaren zu den kleinsten bisher bekannten eukaryotischen Genomen. Im Zuge der Anpassung an die intrazelluläre Lebensweise hat E. cuniculi viele Biosynthese-Wege, unter anderem auch die Aminosäure-Biosynthese verloren (Katinka et al., 2001). Dies deutet auf eine extreme metabolische Abhängigkeit von der Wirtszelle hin. Um für E. cuniculi zugänglich zu sein, müssen Nährstoffe jedoch zunächst die parasitophore Vakuolenmembran passieren. Die Mikroinjektion verschiedener Membran-impermeabler Dextran-Farbstoffe und Fluoreszenzgekoppelter Peptide in das Cytosol infizierter Zellen zeigte, dass die PVM Poren enthält, die eine Ausschlussgröße von 3-10 kDa besitzen. Die PVM sollte somit für Nährstoffe wie z. B. Kohlenhydrate, Aminosäuren und ATP durchlässig sein. Die Permeabilitätseigenschaften der PVM sind dabei unabhängig von Alter oder Größe der Vakuole, so dass E. cuniculi während des intrazellulären Zyklus gleichbleibend Zugang zu den Nährstoffen der Wirtszelle hat.
Schlagwörter: Mikrosporidien; Encephalitozoon cuniculi; parasitophore Vakuole