Die parasitophore Vakuole des Mikrosporidiums Encephalitozoon cuniculi: Biogenese und Metabolitaustausch

Abstract

Mikrosporidien besitzen einen einzigartigen Invasionsmechanismus, bei dem ein so genannter Polartubulus explosionsartig aus der Mikrosporidien-Spore geschleudert wird. Das bisherige Infektionsmodell postuliert, dass der Polartubulus beim Herausschleudern die Plasmamembran einer benachbarten Wirtszelle durchschlägt und das infektiöse Sporoplasma durch den schlauchartigen Polartubulus direkt in das Cytosol der Wirtszelle injiziert wird. Mikrosporidien der Gattung Encephalitozoon sind sehr schnell nach der Invasion von einer parasitophoren Vakuolenmembran (PVM) umgeben. Aufgrund des ungewöhnlichen Invasionsmechanismus von Mikrosporidien und der Abwesenheit von Wirtszell-Markerproteinen in der PVM von Encephalitozoon cuniculi direkt nach der Invasion (Fasshauer et al., 2005) war es bisher unklar, ob die PVM mit dem Sporoplasma übertragen wird, und somit vom Mikrosporidium selbst stammt, oder aber von der Wirtszelle gebildet wird. In dieser Arbeit wurde eine selektive Fluoreszenzmarkierung von entweder E. cuniculi-Membranen oder Wirtszell-Plasmamembran genutzt, um die Beteiligung von Mikrosporidium und Wirtszelle an der Biogenese der PVM zu untersuchen. Wurden E.cuniculi-Membranen mit dem fluoreszierenden Lipid BODIPY-500/510-C12-Phosphocholine markiert, und die markierten Sporen für die Infektion von Wirtszellen verwendet, so war das Fluoreszenzsignal nur in den entstandenen Meronten, nicht aber in der parasitophoren Vakuolenmembran zu finden. E. cuniculi-Membranen tragen somit nicht signifikant zur Bildung der PVM bei. Wurde allerdings die Wirtszell-Plasmamembran mit den raft- und nonraft-spezifischen Lipiden DiIC16 und SPEEDY DiO markiert, so waren beide Farbstoffe sehr schnell nach der Infektion in den entstandenen Vakuolenmembranen nachweisbar. Die Lipide für die Bildung der PVM stammen somit von der Wirtszelle, wobei sowohl raft- als auch nonraft-Lipide zur Biogenese beitragen. Um den zeitlichen Ablauf der PVM-Biogenese zu verfolgen, wurde die Invasion von E. cuniculi in lebenden, Fluoreszenz-markierten Wirtszellen mittels time-lapse -Mikroskopie untersucht. Trifft ein polares Filament eine Wirtszelle, entsteht an der Kontaktstelle kurze Zeit vor der Entstehung der parasitophoren Vakuole eine Fluoreszenz-markierte Invagination der Plasmamembran. Diese Beobachtung deutet auf eine Modifikation des bisherigen Invasionsmodells für E. cuniculi hin. Diesem neuen Modell zufolge wird die Plasmamembran nicht durchschlagen, sondern vom Polartubulus eingedrückt, so dass eine lange Kanalähnliche Invagination entsteht. Das Sporoplasma wird dann nicht in das Cytosol, sondern in diese Invagination injiziert, so dass die parasitophore Vakuole aus Plasmamembran-Material entsteht. In früheren Kolokalisationsstudien wurde gezeigt, dass die PVM den humanen Transferrin-Rezeptor, der als Markerprotein für Wirtszell-Oberflächenproteine gilt, nicht enthält (Fasshauer et al., 2005). Da in dieser Arbeit nachgewiesen wurde dass die PVM aus der Wirtszell-Plasmamembran entsteht, wurde im Folgenden überprüft, ob auch andere Wirtszell-Oberflächenproteine auf der PVM fehlen. Eine Biotinylierung der Wirtszell-Oberflächenproteine, gefolgt von einer Infektion mit E. cuniculi zeigte, dass in der überwiegenden Anzahl (> 90 %) der entstandenen Vakuolen keine Wirtszell-Oberflächenproteine nachweisbar waren. Es scheint somit ein Mechanismus zu existieren, der Wirtszell-Oberflächenproteine entweder während der Entstehung der parasitophoren Vakuole oder aber in den ersten Minuten nach der Invasion aussortiert. Der Ausschluss von Wirtszellproteinen von der PVM ist bei E. cuniculi wahrscheinlich ähnlich wie bei Toxoplasma gondii für die Fusions-Inkompetenz der Vakuole mit Endosomen und Lysosomen verantwortlich, da die für die Membranfusion notwendigen Proteine in der PVM fehlen. Das Genom von E. cuniculi gehört mit einer Größe von ca. 2,9 Millionen Basenpaaren zu den kleinsten bisher bekannten eukaryotischen Genomen. Im Zuge der Anpassung an die intrazelluläre Lebensweise hat E. cuniculi viele Biosynthese-Wege, unter anderem auch die Aminosäure-Biosynthese verloren (Katinka et al., 2001). Dies deutet auf eine extreme metabolische Abhängigkeit von der Wirtszelle hin. Um für E. cuniculi zugänglich zu sein, müssen Nährstoffe jedoch zunächst die parasitophore Vakuolenmembran passieren. Die Mikroinjektion verschiedener Membran-impermeabler Dextran-Farbstoffe und Fluoreszenzgekoppelter Peptide in das Cytosol infizierter Zellen zeigte, dass die PVM Poren enthält, die eine Ausschlussgröße von 3-10 kDa besitzen. Die PVM sollte somit für Nährstoffe wie z. B. Kohlenhydrate, Aminosäuren und ATP durchlässig sein. Die Permeabilitätseigenschaften der PVM sind dabei unabhängig von Alter oder Größe der Vakuole, so dass E. cuniculi während des intrazellulären Zyklus gleichbleibend Zugang zu den Nährstoffen der Wirtszelle hat.