Structural and biochemical characterization of diheme c-type cytochromes
Strukturelle und biochemische Charakterisierung von dihäm c-Typ Cytochromen
by Daniel Heitmann
Date of Examination:2008-10-24
Date of issue:2008-12-04
Advisor:Prof. Dr. Oliver Einsle
Referee:Prof. Dr. Oliver Einsle
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Cytochromes are an abundant family of proteins incorporating heme as a prosthetic group and are involved in processes of electron conduction or redox reactions. Heme consists of an aromatic porphyrin macrocycle and the central coordinated iron ligand. Cytochromes of the c-type bind the heme group covalently to the protein backbone. A conserved amino acid heme binding motif is therefore providing two cysteine sulfhydryl groups, to which the heme group is attached via two thioether bonds. The covalent attachment allows for unique properties, such as massive heme group clustering within a protein. X-ray crystallography experiments revealed the presence of a perpendicular and a parallel structural conserved heme group packing motif. Investigations on these motifs are often complicated by the sheer number of heme groups in multi heme cytochromes, as biochemical and spectroscopic data is summing up and therefore indistinguishable.The recombinant diheme c-type cytochrome DHC2 from the anaerobic microorganism Geobacter sulfurreducens was overexpressed in Escherichia coli and purified to homogeneity using affinity- and gelfiltration chromatography. The protein was characterized using UV/Vis absorption spectroscopy, electron paramagnetic resonance spectroscopy and redox titrations. DHC2 was crystallized and its structure solved by an X-ray diffraction experiment.The structure is showing two monomers in the asymmetric unit, as well as two covalently bound heme groups per monomer, showing a structural conserved heme packing motif. The structural arrangement of amino acids at the heme groups is reflected by results from the electron paramagnetic resonance spectroscopy, as histidine imidazole planes show a small dihedral angle in mutual plane arrangement. The observed mid-point potentials of -135 mV and -289 mV are a result of the specific geometry of heme groups and their ligands respectively. During the structure refinement process unusual high refinement R-factors were recognized, which were indicating a problem with DHC2 crystals. For this reason, an analysis of diffraction data was carried out, showing the presence of pseudo-merohedral twinning in crystals of DHC2. Two twin domains build up the crystal in a ratio of 2:1 using the twin law l, -k, h. The twinning by pseudo-merohedry is allowed due to pseudo-orthorhombic non-crystallographic symmetry. The order disorder (OD) theory describes the crystal as being composed of layers, forming the crystal lattice by translation. The weak binding energies connecting these layers are reflecting weak protein interactions, and are therefore responsible for the ambiguous translation operation, forming the crystal. These weak contacts seem to be responsible for twinning in the case of DHC2.To eliminate twinning a site directed mutagenesis study was carried out. A structural characterized mutant is showing improved diffraction behaviour, higher crystallographic symmetry and no presence of twinning. The structural model is differing from the wild-type model in the region, where the mutagenesis was carried out. The only drawback from this mutation is non-crystallographic translation symmetry having a negative effect on reflection intensities.
Keywords: X-ray crystallography; <i>c</i>-type cytochrome; OD-theory; twinning; pseudo-symmetry
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Cytochrome sind eine weit verbreitete Proteinfamilie die Häm als prosthetische Gruppe beinhalten und in Vorgängen der Elektronenleitung oder Redoxreaktionen involviert sind. Das Hämmolekül besteht aus einem aromatischen Porphyrinring und einem zentral gebundenem Eisenatom. Cytochrome des c-Typs zeichnen sich durch die kovalente Bindung des Häms an das Proteinrückgrat aus. Ein auf Aminosäurebene konserviertes c-Typ Cytochrom Proteinbindemotiv stellt mit zwei Cysteinen, Sulfhydrylgruppen zur Verfügung, an die das Häm mittels zweier Thioetherbindungen angeheftet werden kann. Diese kovalente Bindung an das Protein ermöglicht den c-Typ Cytochromen einzigartige Eigenschaften, z.B. eine enge Anordnung von einer Vielzahl an Hämgruppen innerhalb des Proteins. Röntgenkristallographische Strukturaufklärung enthüllte das Vorhandensein zwei verschiedener Hämgruppenanordnungen. Ein paralleles und ein senkrechtes Packungsmotiv sind strukturell konserviert. Untersuchungen dieser Packungsmotive werden durch eine große Anzahl von Hämgruppen in Multihämcytochromen erschwert, da sich biochemische und spektroskopische Charakteristika mehrerer Hämgruppen aufsummieren und nicht unterscheidbar sind.Das rekombinante c-Typ Dihämcytochrom DHC2 aus dem anaeroben Mikroorganismus Geobacter sulfurreducens wurde in dem Bakterium Escherichia coli überexprimiert und mittels Affinitätschromatographie bzw. Gelfiltrationschromatographie bis zur Homogenität aufgereinigt. Das Protein wurde mittels UV/Vis-Spektralphotometrie, Elektronenspinresonanzspektroskopie und einer Redoxtitration charakterisiert. DHC2 wurde kristallisiert und mittels eines röntgenkristallograpischen Beugungsexperiments strukturell charakterisiert.Die Struktur zeigt das Vorhandensein von zwei Monomeren in der asymmetrischen Einheit, sowie zwei kovalent gebundene Hämgruppen in jedem Monomer, die in einem konservierten parallelen Packungsmotiv angeordnet sind. Die strukturelle Anordnung von Aminosäuren an den Hämgruppen spiegeln die Beobachtungen aus der Elektronenspinresonanzspektroskopie wieder, da die Imidazolringebenen der Histidinliganden einen kleinen dihedralen Winkel zueinander aufweisen. Die beobachteten Mittelpunktspotentiale von -135 mV und -289 mV werden durch die spezifische Geometrie der Hämgruppen und ihrer Liganden erreicht. Während der Strukturverfeinerung von DHC2 wurden ungewöhnlich hohe R-Faktoren für den Grad der Verfeinerung festgestellt, dies deutete auf ein Problem innerhalb der DHC2 Kristalle hin. Daher wurde eine intensive Analyse der kristallographischen Daten durchgeführt. Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigte, dass die Kristalle von DHC2 pseudo-merohedral verzwillingt sind. Der Kristall besteht aus zwei Zwillingsdomänen in einem Verhältnis von 2:1 mit dem Verzwillingungsgesetz l, -k, h. Die pseudo-merohedrale Verzwillingung wird durch eine pseudo-orthorhombische nicht-kristallographische Symmetrie ermöglicht. Der Kristall besteht der Ordnungs- und Disordnungstheorie (OD) zufolge aus Schichten, die durch Translation den Kristall aufbauen. Schwache Bindungen der einzelnen Proteinmoleküle führen zu einer uneindeutigen Translation dieser Schichten. Die Verzwillingung ist somit ein Resultat der Proteinkontakte innerhalb des Kristalls.Eine Mutationsstudie an DHC2 wurde mit dem Zweck durchgeführt diese Verzwillingung zu beseitigen. Eine strukturell charakterisierte Mutante zeigt dabei ein verbessertes Streuvermögen, eine höhere Symmetrie der Kristallstruktur und eine Beseitigung des Verzwillungsphänomens. Die strukturelle Anordnung des Proteins unterscheidet sich nur im Bereich der Mutation vom Wildtyp. Das Vorhandensein nicht-kristallographischer Translationssymetrie, repräsentiert den einzigen Nachteil dieser Mutante, da sie sich negativ auf die Intensitäten der gemessenen Beugungsreflexe auswirkt.
Schlagwörter: Röntgenkristallographie; <i>c</i>-Typ Cytochrom; OD-Theorie; Verzwillingung; Pseudosymmetrie