Possible Influences of Circadian Melatonin on the Function of Neurosecretory Neurons and Serotonin-Modulated Behavior on Crayfish.

Abstract

Krebse sind bevorzugte Präparationen für neuroethologische Studien zur Verhaltenskontrolle und zur Untersuchung circadianer physiologischer Rhythmen. Ob das in verschiedenen Krebsarten beschriebene stereotype agonistische Verhalten durch circadiane Schrittmacher kontrolliert wird, habe ich Gruppen von parthenogenetisch reproduzierenden Marmorkrebsen (Procambarus spec.) unter verschiedenen Beleuchtungsbedingungen beobachtet. Wie andere Krebse auch, zeigten isolierte Marmorkrebse rhythmische Lokomotionsaktivität unter regelmäßigen Licht-Dunkel-Wechseln (LD12:12), die über neun Tage im Dauerdunkel (DD) aufrechterhalten wurde. Dies deutete auf die Präsenz endogener circadianer Schrittmacherzentren hin, welche die rhythmische Aktivität unter konstanten Bedingungen aufrechterhielten. Isogenetische Marmorkrebsweibchen führten alle typischen Elemente des bei anderen dekapoden Krebsen beschriebenen agonistischen Verhaltens durch und etablierten stabile, weitgehend lineare Hierarchien. Gruppen von jeweils sechs zuvor isolierten Marmorkrebsen führten zunächst hohe Anzahlen agonistischer Interaktionen mit vergleichsweise hoher Intensität durch, in denen der relative Dominanzstatus der Tiere untereinander festgestellt wurde. Mit Etablierung der Hierarchien sanken Anzahl und Intensität agonistischer Interaktionen, da rangniedere Tiere zunehmend Kämpfen mit der ranghöheren Tieren auswichen. Eine individuelle Analyse der agonistischen Aktivität innerhalb der Krebsgruppen zeigte, dass das absolut dominante Individuum an etwa der Hälfte aller Kämpfe beteiligt war und die meisten dieser Konfrontationen selbst initierte. Unter LD12:12 Bedingungen war die agonistische Aktivität der Gruppe genau mit dem 24 Stunden Rhythmus des Lichtwechsels synchronisiert, wobei der Beginn der Perioden mit erhöhter agonistischer Aktivität dem Licht-an Stimulus folgte und dem Licht-aus Stimulus antizipatorisch vorausging. Nach Wechseln zu konstanter Dunkelheit (DD) trat eine erhöhte agonistische Aktivität nur noch zum Zeitpunkt des vorherigen Beginns der Dunkelphase auf. Ein circadianer Rhythmus dieser Aktivität wurde über die gesamte Beobachtungsdauer von vier Tagen in DD mit einer durchschnittlichen Periodendauer von 24,83 ± 1.22 Stunden aufrechterhalten. Im Gegensatz zur rhythmischen Aktivität der untersuchten Gruppen zeigte nur der absolut dominante Flusskrebs einen signifikanten endogenen Rhythmus seiner agonistischen Aktivität. Subordinate Krebse beteiligten sich, je nach Rang in der Hierarchie nur an 19,4 bis 0,03% der gesamten agonistischen Interaktionen und zeigten dabei keinen statistisch signifikanten Rhythmus. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben der Lokomotion isolierter Krebse auch das von mindestens zwei Individuen abhängende agonistische Verhalten von Marmorkrebsen durch endogene circadiane Schrittmacher kontrolliert wird, die durch den exogenen Lichtwechsel synchronisiert werden. Krebse und Insekten sind zwar phylogenetisch verwandte Gruppen, zeigen aber Unterschiede in der funktionellen Organisation ihrer zirkadianen Systeme. Bei Krebsen scheinen mehrere, miteinander wechselwirkende lokale Schrittmacher vorzuliegen, die zumindest teilweise in den optischen Loben lokalisiert sind. Insekten scheinen dagegen ein zentralisierteres circadianes System zu haben, deren Hauptkomponenten in einem spezialisierten Neuropil in den optischen Loben zusammengefasst sind, der Akzessorischen Medulla (AMe). Die AMe der Insekten ist durch Neurone innerviert, die das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF) exprimieren und deshalb PDFMe genannt werden. PDF ist dem Crustacean Pigment Dispersing Hormone (PDH), homologe das bei Krebsen in verschiedene Neuronen exprimiert wird. Mit Hilfe der Immunohistochemie und Backfill Technik konnte ich im Hirn des Marmorkrebses Strukturen identifizieren, die möglicherweise ähnlich zu Schrittmachern den optischen Lobus der Insekten sind. In diese Arbeit wurde das gesamte PDH Neuronensystem im Augenstiel und Hirn des Marmorkrebsens identifiziert, wobei die Ergebnisse auf dreifach PDH-immunoreaktive Gruppen hinweisen, die aufgrund Homologie Kriteriums der ähnlichen Position und spezifischen Qualität homolog zum den Insekten PDFMe homologe zu sein scheinen. Trotzdem wurde keine ähnlich Struktur zu den Insekten AMe gefunden, was darauf hinweist dass die Insekten AMe eine neue Struktur der optische Lobe ist, die nicht in den gemeinsamen Vorfahren der Insekten und Krebsen präsent war. Diese Arbeit öffnet eine neue Sicht auf die Evolution des zirkadianischen Systems der Arthopoda und liefert neue Information über den möglichen Sitz der zirkadianischen Schrittmacher in Krebsen. Melatonin, der klassische Zeitsignal Botenstoff der Saugetiere, ist in den meisten aller untersuchten Organismen präsent. Der Biosynthese Weg des Melatonins umfasst als Zwischenstufen die Indolamine Serotonin (5-HT) und N-acetylserotonin (NAS), welche aus 5-Hydroxytryptophan synthetisiert werden. Serotonin spielt eine wichtige Rolle in verschiedene Funktionen bei Vertebraten und Wirbellosen. Trotzdem, sind die Kenntnisse über Invertebraten N-acetylserotonin relative begrenzt, und auch für Melatonin werden weitere Analyse benötigt um genauere Aussagen über seine Funktionen treffen zu konnen. In dieser Arbeit wurde ein ELISA Protokoll adaptiert um rund um die Uhr (in LD12:12) Melatonin, N-acetylserotonin und Serotonin aus Hirn und Augenstiel des Marmorkrebses Procambarus spec. zu messen. Serotonin wurde durchschnittliche Konzentrationen von 21,05 ± 0,93 ng/ml im Hirn und 6,75 ± 0.36 (mean ± SEM) ng/ml im Augenstiel gefunden. Die NAS Konzentrationen waren, mit 5,65 ± 0,29 ng/ml im Hirn und 3,12 ± 0,23 ng/ml im Augenstiel etwas kleiner als die von Serotonin. Auffälliger weise wurde Melatonin in einer 1000 mal niedrigeren Konzentrationen als NAS detektiert, im Hirn 30.82 ± 1,61 und in Augenstiel 21,66 ± 1,54 pg/ml. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Minima und den Maxima des Melatonins und Serotonins in einem Tages Zyklus wurden in beide Strukturen gefunden. Die NAS Konzentrations-unterschiede waren in beiden Strukturen nicht Signifikant gefunden. Mittels Cosinor Analyse wurde keine signifikante (p ≤ 0.05) Abweichung von einer Sinuskurve mit 24 Stunden Periodenlänge gefunden, wenngleich einige Werte nahe der Signifikanzschwellelagen. Diese Ergebnisse fordern zu den Annahmen nach der Biosynthese Weg des Melatonins im Nervensystem der Arthropoda, bzw. der Flusskrebs Procambarus spec. Die vorliegende Arbeit misst zum ersten mal NAS in Arthropoden und liefert neue Erkenntnis über den metabolische Wege der Melatonin Synthese in Wirbellosen.