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Functional and structural investigation of spliceosomal snRNPs

dc.contributor.advisorWahl, Markus Prof. Dr.de
dc.contributor.authorTrowitzsch, Simonde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:52:02Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:48Zde
dc.date.issued2009-01-20de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD28-3de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-311
dc.description.abstractIn die Expression der meisten eukaryontischen Protein-kodierenden Gene sind Prozessierungsschritte von Vorläufermolekülen der Boten-RNAs (engl. pre-mRNAs), wie z. B. das Spleißen von pre-mRNAs, involviert. Das Spleißen von pre-mRNAs wird von einem aus mehreren Untereinheiten bestehenden Protein-RNA-Enzym, dem Spleißosom, katalysiert. Das Spleißosom lagert sich schrittweise an hochkonservierten Sequenzen des pre-mRNA-Substrats zusammen und wird aus mehreren kleinen Ribonukleoproteinpartikeln (engl. snRNPs) und nicht-snRNP-Proteinen gebildet. In Hefen und Menschen ist das U2 snRNP eine essentielle Komponente beim Spleißen von pre-mRNA-Molekülen, wobei es während der Bildung des Spleißosoms an der Erkennung bzw. Auswahl der Verzweigungsstellen (engl. branch sites) der pre-mRNA-Moleküle und auch während der Katalyse der Spleißreaktion eine Rolle spielt. Ein 12S U2 snRNP besteht aus der U2 snRNA, welche im Komplex mit zwei U2 snRNP-spezifischen Proteinen, U2-A und U2-B , vorliegt, und einem Satz aus sieben so genannten Sm-Proteinen. In katalytisch-aktiven 17S U2 snRNPs sind zusätzlich zwei heteromere Spleißfaktoren zu finden, SF3a und SF3b, welche aus drei (SF3a120, SF3a66 und SF3a60) bzw. sieben (SF3b155, SF3b145, SF3b130, SF3b49, SF3b14a/p14, SF3b14b und SF3b10) Proteinen bestehen. In der Hefe Saccaromyces cerevisiae wurde gezeigt, dass neben den Hefe-Orthologen Hsh155p, Rse1p, Cus1p, Hsh49p, Rds3p und Rcp10p/Ysf3p mindestens zwei weitere Proteine, Bud31p und Snu17p/Ist3p, in SF3b Partikeln präsent sind. Außerdem ist Snu17p auch in einem Komplex mit den Proteinen Pml1p und Bud13p enthalten. Diese drei Proteine formen den pre-mRNA retention and splicing (RES) Komplex, dessen Aktivität dem Austreten von ungespleißten pre-mRNAs aus dem Nukleus entgegenwirkt und welcher für die Aktivierung des Spleißens eines Teils von Mer1p-abhängigen Genen benötigt wird. Ein homologer Komplex ist in humanen präkatalytischen, aktivierten und Schritt 1-Spleißosomen zu finden. Strukturelle Analysen mit Hilfe der Elektronenmikroskopie, Kernresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie lieferten wichtige Einblicke in die Strukturen von 17S U2 snRNP Subkomplexen und Proteinen, allerdings liegen noch keine Modelle von 12S U2 snRNPs, Partikeln des SF3b, sowie des RES Komplexes mit atomarer Auflösung vor. Um atomar aufgelöste Modelle von humanen 12S U2 snRNPs und SF3b Partikeln zu erhalten, begann ich, diese Partikel für Röntgenstrukuranalysen zu produzieren. Ich konnte Reinigungsprotokolle für native, aus HeLa-Zellkultur isolierte 12S U2 snRNPs und SF3b Partikel für kristallographische Analysen optimieren. Da keine Kristalle aus nativen 12S U2 snRNPs gezüchtet werden konnten, wurden vermutlich unstrukturierte Bereiche der U2 snRNA, der Sm-Proteine Sm B/B und der Proteine U2-A und U2-B mit Hilfe eines DNA-gelenkten RNaseH Schnitts, sowie limitierter Proteolyse, erfolgreich entfernt. U2 snRNP Partikel mit verkürzter snRNA oder mit verkürzter snRNA und verkürzten Proteinen Sm B/B wurden der Kristallisation bei einer Konzentration von 10 mg/ml zugeführt. U2 snRNPs mit verkürzter snRNA und verkürzten Proteinen Sm-B/B , U2-A und U2-B konnten in analytischem Maßstab gereinigt werden. Die etablierten Reinigungsprotokolle erlauben eine zukünftige präparative Produktion der Partikel. SF3b Partikel wurden gereinigt und auf Kristallwachstum bei Konzentrationen von mindestens 9 mg/ml überprüft. Während der Präparation von SF3b Partikeln konnte ein bis dato unbekannter Komplex isoliert und charakterisiert werden. Dieser Komplex besteht aus mindestens vier Komponenten, einer DEAD-box Helikase DDX1, sowie den Proteinen HSPC117, Family with sequence similarity 98/member B und CGI-99. Die Assoziation dieses Komplexes mit SF3b Partikeln wird diskutiert. Um das Wissen über das Protein Snu17p und seiner Interaktionspartner zu erweitern, beschäftigte ich mich ferner mit der Charakterisierung des RES Komplexes aus der Bäckerhefe. Hierbei verwendete ich verschiedene, biophysikalische und biochemische Methoden, um die Architektur dieses Komplexes aufzuklären. GST pull-down Experimente und Größenausschlußchromatographie zeigten, dass Snu17p die zentrale Plattform des Komplexes darstellt, wohingegen die zwei anderen Komponenten, Pml1p und Bud13p, nicht miteinander interagieren. Fluorimetrische Struktursondierungen zeigten, dass das gesamte Bud13p und der N-terminale Bereich des Pml1p nativ ungefaltet in isolierter Form vorliegen. Mutationsanalysen und Tryptophanfluoreszenzmessungen bestätigten, dass ein konserviertes Tryptophan-haltiges Motiv im C-terminalen Bereich des Bud13p mit dem Kernbereich des RNA-Bindemotivs des Snu17p interagiert. Ferner zeigten diese Experimente, dass eine C-terminale Extension des RNA-Bindemotivs des Snu 17p für die Binding eines N-terminalen Peptids des Pml1p notwendig ist. Über isothermale Titrationskalorimetrie konnten 1:1 Stöchiometrien, große negative Bindungsentropien und Dissoziationskonstanten im niedrigen nanomolaren, bzw. mikromolaren Bereich für die Snu17p-Bud13p und die Snu17p-Pml1p Interaktionen gezeigt werden. Durch peptide-scanning Experimente konnten die Interaktionsregionen zu Snu17p in Bud13p und Pml1p auf die Aminosäure genau definiert werden. Vorläufige Ergebnisse aus Untersuchungen mit Hilfe der NMR Spektroskopie und limitierter Proteolyse zeigten, dass Snu17p als molten globule-ähnliche Struktur vorliegt und sich durch die Bindung von mindestens einem Interaktionspartner faltet. Folglich interagiert das nicht-kanonische RNA-Bindemotiv des Snu17p mit kurzen, intrinsisch ungefalteten Peptid-Epitopen verschiedener Proteine und agiert dabei als Plattform, um funktionale Module, wie eine forkhead-assoziierte (FHA) Domäne des Pml1p oder ein konserviertes poly-Lysin-Motiv des Bud13p, zu präsentieren. Die Kristallstrukturen des gesamten Pml1p und eines N-terminal verkürzten Pml1p konnten gelöst werden und bestätigten das Vorhandensein einer FHA-Domäne in der C-terminalen Region. FHA-Domänen sind kleine Proteinmodule, welche phosphorylierte Epitope anderer Proteine binden können. Die ersten 50 Reste des Pml1p sind ungeordnet und für die Bindung zum Snu17p verantwortlich. Eine nicht-kanonische N-terminale Verlängerung des Moduls läuft entlang eines -Faltblattes und stabilisiert dadurch die FHA-Domäne des Pml1p. Über strukturbasierte Sequenzvergleiche konnte eine ähnliche Verlängerung im humanen Protein NIPP1 gefunden werden. Interessanterweise wurde NIPP1 erst kürzlich als Spleißosom-assoziiertes Protein beschrieben. Im Kristall des voll-längen Pml1p konnte ein Sulfat-Ion gefunden werden, welches durch Reste der putativen Phosphopeptid-bindenden Schleifenstrukturen koordiniert wird. Kristalle des verkürzten Pml1p Proteins wiesen kein Sulfat-Ion auf, zeigten aber eine nahezu gleiche Struktur des geordneten Bereichs des Pml1p. Eine lange Schleifenstruktur, welche der Phosphopeptid-bindenden Region angrenzt, ist in beiden Strukturen ungeordnet und könnte für die Ligand-Spezifität eine Rolle spielen. Wahrscheinlich erkennt Pml1p phosphorylierte Aminosäuren in Liganden über ein Schlüssel-Schloß-Prinzip, wohingegen die Spezifität womöglich auf einer induced-fit-Interaktion beruht. Die vorgelegten Resultate lassen vermuten, dass Pml1p als Phosphorylierungssensor durch Snu17p zum Spleißosom rekrutiert wird. Basierend auf den in dieser Arbeit präsentierten Resultaten wird ein Modell der molekularen Architektur des RES Komplexes vorgestellt.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleFunctional and structural investigation of spliceosomal snRNPsde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedFunktionale und strukturelle Untersuchung von spleißosomalen snRNPsde
dc.contributor.refereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.date.examination2009-07-02de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengThe expression of most eukaryotic protein-encoding genes involves precursor messenger RNA (pre-mRNA) processing steps including pre-mRNA splicing. Pre-mRNA splicing is catalyzed by a multi-subunit RNA-protein enzyme, the spliceosome, which emerges from the stepwise recruitment of the U1, U2, U5 and U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) and numerous non-snRNP proteins to conserved sequences of the pre-mRNA substrate. The U2 snRNP is essential for splicing in yeast and humans, participating in the recognition/selection of the so-called branch site (BS) of the pre-mRNA during spliceosome assembly and also during the subsequent catalysis of splicing. 12S U2 snRNPs are composed of U2 snRNA, which is complexed by U2 snRNP specific proteins, U2-A' and U2-B'', and seven Sm proteins. In catalytically active human 17S U2 snRNPs, two heteromeric splicing factors, SF3a and SF3b, are additionally found, which contain three (SF3a120, SF3a66 and SF3a60) and seven (SF3b155, SF3b145, SF3b130, SF3b49, SF3b14a/p14, SF3b14b and SF3b10) proteins, respectively. In the yeast Sacharomyces cerevisiae, SF3b complexes were shown to consist of yeast orthologs Hsh155p, Rse1p, Cus1p, Hsh49p, Rds3p, Rcp10p/Ysf3p, and at least two additional proteins Bud31p and Snu17p/Ist3p. Moreover, Snu17p is found in a complex with proteins Pml1p and Bud13p. Together, these three proteins form the pre-mRNA retention and splicing (RES) complex, which counteracts the escape of unspliced pre-mRNAs from the nucleus and activates splicing of a subset of Mer1p-dependent genes. A homologous complex is present in human pre-catalytic, activated and step 1 spliceosomes. Structural analyses by electron microscopy, nuclear magnetic resonance spectroscopy and X-ray crystallography gave important insight into structural arrangements among 17S U2 snRNP subcomplexes and proteins, but atomic models of 12S U2 snRNPs, SF3b particles and the RES complex remained elusive. To derive atomic models of entire human 12S U2 snRNPs and SF3b particles, I set out to produce these particles for X-ray crystallographic analyses. I was able to optimize purification protocols for both natively isolated 12S U2 snRNPs and SF3b complexes. Since no crystals could be obtained from native 12S U2 snRNPs, presumed unstructured regions of U2 snRNA, Sm proteins Sm B/B' and U2-A' and U2-B'' were successfully removed by a DNA-directed RNaseH-based cleavage and limited proteolysis, respectively. U2 snRNP particles with truncated snRNA or a truncated snRNA and truncated proteins Sm B/B' were subjected to crystallization at a concentration of at least 10 mg/ml. U2 snRNP particles with truncated snRNA, truncated proteins Sm B/B' and truncated U2-A' and U2-B'' were obtained in analytical scale. The established purification protocols would allow preparative production in the future. SF3b particles were purified and screened for crystal growth at concentrations of at least 9 mg/ml. During the preparation of SF3b particles, a yet unknown complex could be isolated and characterized. It comprises at least 4 proteins, including the DEAD-box helicase DDX1 and proteins HSPC117, Family with sequence similarity 98/member B and CGI-99. Its association with SF3b particles is discussed. To expand knowledge about Snu17p and its interaction partners, I set out to characterize yeast RES complexes by biophysical and biochemical methods, with the ultimate goal to elucidate the molecular architecture of the RES complex. GST pull-down experiments and size exclusion chromatography revealed that Snu17p constitutes the central platform of the complex, while Bud13p and Pml1p do not interact with each other. Fluorimetric structure probing showed the entire Bud13p and the N-terminal third of Pml1p to be natively disordered in isolation. Mutational analysis and tryptophan fluorescence confirmed that a conserved tryptophan-containing motif in the C-terminus of Bud13p binds to the core RRM of Snu17p, while a different interaction surface encompassing a C-terminal extension of the Snu17p RRM is required to bind an N-terminal peptide of Pml1p. Isothermal titration calorimetry revealed 1:1 interaction stoichiometries, large negative binding entropies and dissociation constants in the low nanomolar and micromolar ranges for the Snu17p-Bud13p and the Snu17p-Pml1p interactions, respectively. By performing peptide-scanning experiments, the Snu17p interacting regions of Bud13p and Pml1p could be further delineated with single amino acid resolution. Preliminary results from NMR spectroscopy and limited proteolysis indicate that Snu17p persists in a molten globule like structure and folds upon binding of at least one of the interating peptides. Thus, the non-canonical Snu17p RRM concomitantly binds multiple ligand proteins via short, intrinsically unstructured peptide epitopes and thereby acts as a platform that displays functional modules of the ligands, such as a forkhead-associated domain of Pml1p and a conserved poly-lysine motif of Bud13p. The crystal structures of full-length and N-terminally truncated Pml1p were determined and revealed the presence of a forkhead-associated (FHA) domain fold in the C-terminal region. FHA domains are small protein modules, which bind phosphorylated epitopes on proteins. The first 50 residues of Pml1p, encompassing the Snu17p-binding region, are disordered. A non-canonical N-terminal expansion runs across one -sheet and, thereby, critically stabilizes the domain. Structure based alignments identified a similar expansion in the human protein NIPP1, which was previously shown to be associated with spliceosomes. A sulfate ion was found at the putative phosphopeptide-binding loops of full-length Pml1p while the truncated protein lacked a similar phosphopeptide mimic but retained an almost identical structure. A long loop neighboring the phosphopeptide-binding site was disordered in both structures and may confer ligand specificity. It is speculated that Pml1p most likely recognizes the phosphorylated amino acid of ligands by a lock-and-key mechanism, while specificity relies on induced-fit interactions. The results suggest that Snu17p recruits Pml1p as a phosphorylation sensor to the spliceosome. Finally, a model of the molecular architecture of the RES complex is presented.de
dc.contributor.coRefereeEinsle, Oliver Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerRöntgenkristallographiede
dc.subject.gersnRNPde
dc.subject.gerSpleißende
dc.subject.gerintrinsisch ungefaltete Domänede
dc.subject.gerforkhead-assoziierte Domänede
dc.subject.gerProteinphosphorylierungde
dc.subject.gerRES Komplexde
dc.subject.engX-Ray Crystallographyde
dc.subject.engsnRNPde
dc.subject.engsplicingde
dc.subject.engintrinsically unstructured domainde
dc.subject.engforkhead-associated domainde
dc.subject.engpre-mRNA retention and splicingde
dc.subject.engprotein phosphorylationde
dc.subject.engRES complexde
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2004-6de
dc.identifier.purlwebdoc-2004de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 000: Molekularbiologie, Gentechnologiede
dc.identifier.ppn614256887de


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