Mechanismen der Inhibierung von Wirtszellapoptose durch Toxoplasma gondii
Inhibition mechanisms of host cell apoptosis by Toxoplasma gondii
von Diana Hippe
Datum der mündl. Prüfung:2008-10-30
Erschienen:2009-02-02
Betreuer:PD Dr. Carsten Lüder
Gutachter:Prof. Dr. Uwe Groß
Gutachter:Prof. Dr. Jörg Stülke
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular apicomplexan parasite. Due to its broad spectrum of hosts and its lifelong persistence in the host it is one of the most successful parasites. Infection of immunocompetent individuals is mostly asymptomatic, but infection of fetuses or immunocomprimised patients can induce life-threatening toxoplasmosis with severe symptoms, particularly in the central nervous system. T. gondii has evolved different strategies to evade the immune system of its host and to facilitate its own intracellular survival. Apoptosis is a common form of programmed cell death and represents an important defense mechanism against intracellular pathogens. Apoptosis in infected cells can be induced by intrinsic signals, e.g. cellular stress or by cytotoxic T-lymphocytes and natural killer cells that bind to surface death receptors on the infected cell. Apoptosis of infected cells counteracts replication of intracellular pathogens and facilitates antigen presentation after phagocytosis of infected apoptotic cells. However, T. gondii is able to inhibit apoptosis that was induced in its host cell by different pro-apoptotic stimuli. So far, the molecular and cellular mechanisms of this inhibition have not yet been fully elucidated. The aim of this study was to identify and characterise the inhibitory mechanisms employed by T. gondii to prevent apoptosis after ligation of Fas/CD95 or after activation of the intrinsic signaling cascade in its host.In the present study, the inhibition of the extrinsic signaling pathway was investigated in Fas-transfected HeLa-cells, representing so called type II-cells, after infection with T. gondii. In this type of cells, apoptosis induced by activation of the extrinsic signaling pathway depends on the activation of the mitochondrial amplification loop. T. gondii was able to efficiently block apoptosis after ligation of Fas/CD95 in these type II-cells. Additionally, Fas-induced activity of caspase 8, -9 and -3/7 and also cleavage of Bid were dose-dependently reduced after infection with increasing amounts of T. gondii. Ligation of Fas/CD95 led to a strong activation of the mitochondrial apoptotic signaling pathway as revealed by detection of cytochrome c-release out of the mitochondria and strong activation of caspase 9. Furthermore, treatment with caspase 9-inhibitors and caspase 9-deficient cells showed that execution of apoptosis in type II-cells was critically dependent on positive feedback mechanisms of effector caspases. However, Fas/CD95-induced cytochrome c-release into the host cell cytosol and activation of caspase 9 were clearly inhibited after infection with T. gondii. The inhibition of Fas/CD95-mediated apoptosis by T. gondii partially depended on the inhibition of caspase 8 activity. As it has been already shown in type I-cells, T. gondii induced an abberrant cleavage of caspase 8 which was followed by its degradation and the inhibition of proteolytic cleavage of caspase 8 after ligation of Fas/CD95 into active subunits. However, experiments using caspase 9-deficient Jurkat cells and caspase 9-expressing revertant cells unambiguously showed that this inhibitory mechanism contributed only to a minor extent to the total inhibition of Fas/CD95-mediated apoptosis in type II-cells. An effective inhibition of Fas/CD95-mediated apoptosis was indeed mainly based upon interference of T. gondii with the mitochondrial amplification loop. The modulation of Bcl-2-proteins which has been also shown in this study to be altered after T. gondii-infection may play a major role during the inhibition of the mitochondrial amplification loop by T. gondii. However, interference with apoptosome formation as described earlier cannot be completely excluded as an additional inhibitory mechanism.In previous studies, it could not be elucidated in detail how T. gondii interferes with cytochrome c-release out of mitochondria after induction of the intrinsic signaling pathway. This study now provides clear evidence that infection with T. gondii efficiently inhibited apoptosis after inducible expression of the BH3-only protein BimS. Furthermore the activities of caspase 9, -3/7 and -8 were dose-dependently reduced after parasitic infection. Importantly, the present study provides clear evidence that T. gondii interferes with the apoptotic signaling cascade between the inducible expression of BimS and cytochrome c-release out of mitochondria. Such interference by T. gondii was also confirmed after inhibition of effector caspases, thereby, ruling out the involvement of positive feedback mechanisms during inhibition of the mitochondrial apoptotic pathway by the parasite. Most importantly, it has been shown for the first time that T. gondii blocks activation, but not protein expression of the pivotal pro-apoptotic proteins Bax and Bak, thereby inhibiting cytochrome c-release out of mitochondria after intrinsic pro-apoptotic stimuli. Furthermore, translocation of Bax to the mitochondria and subsequent oligomerisation within the mitochondrial membrane was clearly decreased by infection with T. gondii. In addition to the inhibition of Bax- and Bak-activation, the degradation of the additional cell-type specific pro-apoptotic protein Bok in HeLa-derived cells could contribute to the parasite-imposed inhibition of apoptosis in a cell type-dependent manner. Nevertheless, data of this study proved that activation of Bax and Bak in T. gondii-infected cells was inhibited independent of an increased expression of anti-apoptotic BH4-proteins and reduced expression of pro-apoptotic BH3-only proteins by T. gondii. An invasion of the parasite into the host cell was required for T. gondii-mediated inhibition of cytochrome c release. Additionally, the inhibition of apoptosis was not due to an induced transcription of anti-apoptotic molecules after infection, suggesting that the interference of T. gondii with Bcl-2-proteins may result from a d irect interaction between the parasite and its host cell. A putative secretion of parasitic anti-apoptotic effector molecules into the host cell by T. gondii was supported by the kinetics of the inhibition of the intrinsic apoptotic pathway. They showed that the inhibitory potential increased early after infection and almost completely inhibited effector caspases 3/7 after 9 to 12 hours of infection. Thus, the present study revealed an hitherto unknown mechanism of interference of T. gondii with activation of pro-apoptotic Bcl-2-proteins. This mechanism may considerably contribute to the inhibition of the intrinsic apoptotic pathway in T. gondii-infected cells.In conclusion, T. gondii has evolved different strategies to efficiently prevent cell death of its host cell, partially depending on cell type and apoptosis induction. The inhibition of apoptosis by T. gondii facilitates the intracellular replication of the parasite and may promote dissemination of the parasite in its host organism.
Keywords: <i>Toxoplasma gondii</i>; apoptosis; caspase; Fas/CD95;Bcl-2-proteins; BH3-only protein
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Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer Parasit des Phylums Apikomplexa, der durch sein breites Wirtsspektrum und die lebenslange Persistenz in seinem Wirt zu einem der erfolgreichsten Parasiten gehört. Eine Infektion verläuft bei immunkompetenten Personen meist symptomlos, bei Föten oder immungeschwächten Patienten kann sie jedoch zur Toxoplasmose mit schweren Schädigungen, vor allem des zentralen Nervensystems, führen. T. gondii hat unterschiedliche Strategien entwickelt, dem Immunsystem seines Wirtes zu entgehen und sein intrazelluläres Überleben zu erleichtern. Die Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods und stellt einen wichtigen Abwehrmechanismus gegen intrazelluläre Erreger dar. So können intrinsische Stresssignale oder zytotoxische T-Lymphozyten und NK-Zellen Apoptose in infizierten Zellen auslösen. Die Vermehrung intrazellulärer Pathogene kann durch den Zelltod infizierter Zellen verhindert und nach Phagozytose apoptotischer infizierter Zellen die Antigenpräsentation stimuliert werden. T. gondii ist jedoch in der Lage, die Apoptose nach unterschiedlichen pro-apoptotischen Stimuli zu inhibieren. Die molekularen und zellulären Mechanismen der Apoptosehemmung durch Toxoplasma sind bisher jedoch nicht ausreichend aufgeklärt. In dieser Studie sollten daher die Inhibierungsmechanismen von T. gondii in Zellen, in denen Apoptose durch Ligation von Fas/CD95 oder Aktivierung des intrinsischen Signalweges ausgelöst wurde, identifiziert und charakterisiert werden.In der vorliegenden Arbeit wurde die Hemmung der extrinsisch ausgelösten Apoptose in Fas/CD95-transfizierten HeLa-Zellen, sogenannten Typ II-Zellen, nach Infektion mit T. gondii untersucht. In diesen Zellen wird nach Aktivierung des extrinsischen Apoptosesignalweges zusätzlich die mitochondriale Amplifikationsschleife aktiviert. Eine Infektion mit T. gondii verhinderte in diesen Typ II-Zellen effektiv die Apoptose nach Fas/CD95-Ligation. T. gondii reduzierte außerdem dosisabhängig die Fas/CD95-vermittelte Aktivität von Caspase 8, -9 und 3/7 sowie die Spaltung von Bid. Die Ligation von Fas/CD95 führte zu einer starken Aktivierung des intrinsischen Apoptosesignalweges, wie anhand der Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien und einer deutlichen Aktivierung der Caspase 9 nachgewiesen wurde. Die Verwendung von Caspase 9-Inhibitoren und Caspase 9-defizienten Zellen zeigte weiterhin, dass die Exekution der Apoptose in Typ II-Zellen wesentlich von der Aktivierung des mitochondrialen Amplifikationsloops und Feedbackmechanismen der Effektorcaspasen abhing. Nach Infektion mit T. gondii waren die Cytochrom c-Ausschüttung ins Wirtszellcytosol sowie die Aktivierung der Caspase 9 deutlich gehemmt. Die Hemmung der Fas/CD95-vermittelten Apoptose in Typ II-Zellen nach Infektion mit T. gondii beruhte dabei zum Teil auf der Hemmung der Caspase 8-Aktivität. Ähnlich wie bereits für Typ I-Zellen nachgewiesen, induzierte T. gondii in HeLa-Fas-Zellen eine alternative Spaltung der Caspase 8, die eine Degradierung der Caspase 8 zur Folge hatte und die proteolytische Spaltung von Caspase 8 in aktive Untereinheiten nach Fas/CD95-Ligation verhinderte. Untersuchungen an Caspase 9-defizienten Jurkat-Zellen und Caspase 9-exprimierenden Revertanten zeigten jedoch deutlich, dass dieser Inhibierungsmechanismus nur geringfügig zu der Hemmung der Fas/CD95-vermittelten Apoptose in Typ II-Zellen beitrug. Eine effektive Hemmung der Fas/CD95-vermittelten Apoptose beruhte dagegen im Wesentlichen auf der Interferenz von T. gondii mit dem mitochondrialen Amplifikationsloop. Dabei dürfte die in dieser Arbeit gezeigte Modulation der Bcl-2-Proteine eine wichtige Rolle spielen. Allerdings kann eine zusätzliche Inhibierung durch Verhinderung der Apoptosombildung nicht komplett ausgeschlossen werden.Wie T. gondii die Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien des intrinsischen Apoptosesignalweges verhindert, konnte in früheren Arbeiten nicht detailliert geklärt werden. In dieser Studie wurde nun gezeigt, dass nach induzierter Expression des BH3-only Proteins BimS eine Infektion mit Toxoplasma die Apoptose sehr effektiv hemmte und dabei die Aktivitäten der Caspasen 9, -3/7, und 8 dosisabhängig reduzierte. Nach Hemmung der Feedback-Aktivierung des mitochondrialen Apoptoseweges durch Effektorcaspasen konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass T. gondii mit der Signalkaskade zwischen Expression von BimS und der Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien interferierte. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig nachgewiesen, dass T. gondii die Aktivierung, jedoch nicht die Proteinexpression der zentralen pro-apoptotischen Proteine Bax und Bak blockierte und dadurch die Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien nach pro-apoptotischen Stimuli hemmte. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass die Translokation von Bax in T. gondii-infizierten Zellen an die Mitochondrien und die darauffolgende Oligomerisierung in der Mitochondrienmembran verhindert wurde. Neben der Hemmung der Bax- und Bak- Aktivierung könnte die T. gondii-vermittelte Degradierung des zusätzlichen Multidomänenproteins Bok in HeLa-abgeleiteten Zellen zelltypspezifisch zu der Apoptosehemmung beitragen. Die Daten dieser Arbeit belegen deutlich, dass die Aktivierung von Bax und Bak unabhängig von einer verstärkten Expression anti-apoptotischer BH4-Proteine und verminderterten Expression pro-apoptotischer BH3-only-Proteine durch T. gondii gehemmt wurde. Für eine effektive T. gondii-vermittelte Inhibierung der Cytochrom c-Freisetzung war eine Invasion des Parasiten in die Wirtszelle notwendig. Da die Inhibierung nicht auf einer induzierten Transkription anti-apoptotischer Moleküle beruhte, dürfte die Interferenz von T. gondii mit Bcl-2-Proteinen aus einer direkten Interaktion von Parasit und Wirtszelle resultieren. Eine mögliche Sekretion von parasitären anti-apoptotischen Effektormolekülen in die Wirtszelle wurde auch durch den Zeitverlauf der Hemmung des intrinsisch en Apoptosesignalweges unterstützt, der zeigte, dass das Inhibierungspotential nach Infektion mit der Zeit zunahm und nach 9-12 Stunden eine fast vollständige Hemmung der Effektorcaspasen 3/7 erreicht war. In dieser Arbeit wurde damit ein bisher unbekannter Mechanismus der Interferenz von T. gondii mit der Aktivierung pro-apoptotischer Bcl-2-Proteine nachgewiesen, der wesentlich zur Hemmung des intrinsischen Apoptoseweges in Toxoplasma-infizierten Zellen beitragen dürfte.Zusammenfassend hat T. gondii unterschiedliche Strategien entwickelt, je nach Zelltyp und Apoptoseinduktion den Zelltod seiner Wirtszelle effektiv zu verhindern. Die Inhibierung der Apoptose durch T. gondii erleichtert die intrazelluläre Vermehrung des Parasiten und dürfte die Verbreitung des Parasiten im Organismus wesentlich begünstigen.
Schlagwörter: <i>Toxoplasma gondii</i>; Apoptose; Caspase; Fas/CD95;Bcl-2-Proteine; BH3-only Protein