Mechanismen der Inhibierung von Wirtszellapoptose durch <i>Toxoplasma gondii</i>

Abstract

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer Parasit des Phylums Apikomplexa, der durch sein breites Wirtsspektrum und die lebenslange Persistenz in seinem Wirt zu einem der erfolgreichsten Parasiten gehört. Eine Infektion verläuft bei immunkompetenten Personen meist symptomlos, bei Föten oder immungeschwächten Patienten kann sie jedoch zur Toxoplasmose mit schweren Schädigungen, vor allem des zentralen Nervensystems, führen. T. gondii hat unterschiedliche Strategien entwickelt, dem Immunsystem seines Wirtes zu entgehen und sein intrazelluläres Überleben zu erleichtern. Die Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods und stellt einen wichtigen Abwehrmechanismus gegen intrazelluläre Erreger dar. So können intrinsische Stresssignale oder zytotoxische T-Lymphozyten und NK-Zellen Apoptose in infizierten Zellen auslösen. Die Vermehrung intrazellulärer Pathogene kann durch den Zelltod infizierter Zellen verhindert und nach Phagozytose apoptotischer infizierter Zellen die Antigenpräsentation stimuliert werden. T. gondii ist jedoch in der Lage, die Apoptose nach unterschiedlichen pro-apoptotischen Stimuli zu inhibieren. Die molekularen und zellulären Mechanismen der Apoptosehemmung durch Toxoplasma sind bisher jedoch nicht ausreichend aufgeklärt. In dieser Studie sollten daher die Inhibierungsmechanismen von T. gondii in Zellen, in denen Apoptose durch Ligation von Fas/CD95 oder Aktivierung des intrinsischen Signalweges ausgelöst wurde, identifiziert und charakterisiert werden.In der vorliegenden Arbeit wurde die Hemmung der extrinsisch ausgelösten Apoptose in Fas/CD95-transfizierten HeLa-Zellen, sogenannten Typ II-Zellen, nach Infektion mit T. gondii untersucht. In diesen Zellen wird nach Aktivierung des extrinsischen Apoptosesignalweges zusätzlich die mitochondriale Amplifikationsschleife aktiviert. Eine Infektion mit T. gondii verhinderte in diesen Typ II-Zellen effektiv die Apoptose nach Fas/CD95-Ligation. T. gondii reduzierte außerdem dosisabhängig die Fas/CD95-vermittelte Aktivität von Caspase 8, -9 und 3/7 sowie die Spaltung von Bid. Die Ligation von Fas/CD95 führte zu einer starken Aktivierung des intrinsischen Apoptosesignalweges, wie anhand der Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien und einer deutlichen Aktivierung der Caspase 9 nachgewiesen wurde. Die Verwendung von Caspase 9-Inhibitoren und Caspase 9-defizienten Zellen zeigte weiterhin, dass die Exekution der Apoptose in Typ II-Zellen wesentlich von der Aktivierung des mitochondrialen Amplifikationsloops und Feedbackmechanismen der Effektorcaspasen abhing. Nach Infektion mit T. gondii waren die Cytochrom c-Ausschüttung ins Wirtszellcytosol sowie die Aktivierung der Caspase 9 deutlich gehemmt. Die Hemmung der Fas/CD95-vermittelten Apoptose in Typ II-Zellen nach Infektion mit T. gondii beruhte dabei zum Teil auf der Hemmung der Caspase 8-Aktivität. Ähnlich wie bereits für Typ I-Zellen nachgewiesen, induzierte T. gondii in HeLa-Fas-Zellen eine alternative Spaltung der Caspase 8, die eine Degradierung der Caspase 8 zur Folge hatte und die proteolytische Spaltung von Caspase 8 in aktive Untereinheiten nach Fas/CD95-Ligation verhinderte. Untersuchungen an Caspase 9-defizienten Jurkat-Zellen und Caspase 9-exprimierenden Revertanten zeigten jedoch deutlich, dass dieser Inhibierungsmechanismus nur geringfügig zu der Hemmung der Fas/CD95-vermittelten Apoptose in Typ II-Zellen beitrug. Eine effektive Hemmung der Fas/CD95-vermittelten Apoptose beruhte dagegen im Wesentlichen auf der Interferenz von T. gondii mit dem mitochondrialen Amplifikationsloop. Dabei dürfte die in dieser Arbeit gezeigte Modulation der Bcl-2-Proteine eine wichtige Rolle spielen. Allerdings kann eine zusätzliche Inhibierung durch Verhinderung der Apoptosombildung nicht komplett ausgeschlossen werden.Wie T. gondii die Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien des intrinsischen Apoptosesignalweges verhindert, konnte in früheren Arbeiten nicht detailliert geklärt werden. In dieser Studie wurde nun gezeigt, dass nach induzierter Expression des BH3-only Proteins BimS eine Infektion mit Toxoplasma die Apoptose sehr effektiv hemmte und dabei die Aktivitäten der Caspasen 9, -3/7, und 8 dosisabhängig reduzierte. Nach Hemmung der Feedback-Aktivierung des mitochondrialen Apoptoseweges durch Effektorcaspasen konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass T. gondii mit der Signalkaskade zwischen Expression von BimS und der Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien interferierte. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig nachgewiesen, dass T. gondii die Aktivierung, jedoch nicht die Proteinexpression der zentralen pro-apoptotischen Proteine Bax und Bak blockierte und dadurch die Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien nach pro-apoptotischen Stimuli hemmte. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass die Translokation von Bax in T. gondii-infizierten Zellen an die Mitochondrien und die darauffolgende Oligomerisierung in der Mitochondrienmembran verhindert wurde. Neben der Hemmung der Bax- und Bak- Aktivierung könnte die T. gondii-vermittelte Degradierung des zusätzlichen Multidomänenproteins Bok in HeLa-abgeleiteten Zellen zelltypspezifisch zu der Apoptosehemmung beitragen. Die Daten dieser Arbeit belegen deutlich, dass die Aktivierung von Bax und Bak unabhängig von einer verstärkten Expression anti-apoptotischer BH4-Proteine und verminderterten Expression pro-apoptotischer BH3-only-Proteine durch T. gondii gehemmt wurde. Für eine effektive T. gondii-vermittelte Inhibierung der Cytochrom c-Freisetzung war eine Invasion des Parasiten in die Wirtszelle notwendig. Da die Inhibierung nicht auf einer induzierten Transkription anti-apoptotischer Moleküle beruhte, dürfte die Interferenz von T. gondii mit Bcl-2-Proteinen aus einer direkten Interaktion von Parasit und Wirtszelle resultieren. Eine mögliche Sekretion von parasitären anti-apoptotischen Effektormolekülen in die Wirtszelle wurde auch durch den Zeitverlauf der Hemmung des intrinsisch en Apoptosesignalweges unterstützt, der zeigte, dass das Inhibierungspotential nach Infektion mit der Zeit zunahm und nach 9-12 Stunden eine fast vollständige Hemmung der Effektorcaspasen 3/7 erreicht war. In dieser Arbeit wurde damit ein bisher unbekannter Mechanismus der Interferenz von T. gondii mit der Aktivierung pro-apoptotischer Bcl-2-Proteine nachgewiesen, der wesentlich zur Hemmung des intrinsischen Apoptoseweges in Toxoplasma-infizierten Zellen beitragen dürfte.Zusammenfassend hat T. gondii unterschiedliche Strategien entwickelt, je nach Zelltyp und Apoptoseinduktion den Zelltod seiner Wirtszelle effektiv zu verhindern. Die Inhibierung der Apoptose durch T. gondii erleichtert die intrazelluläre Vermehrung des Parasiten und dürfte die Verbreitung des Parasiten im Organismus wesentlich begünstigen.