SUMOylierung von NFYA
Einfluss auf Interaktionen und Kerntransport
SUMOylation of NFYA
Influence on interaction and nucleocytoplasmic transport
Tina Lampe
Doctoral thesis
Date of Examination:
2009-01-23
Date of issue:
2009-02-13
Advisor:
Melchior, Frauke Prof. Dr.
Referee:
Melchior, Frauke Prof. Dr.
Referee:
Doenecke, Detlef Prof. Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD2F-6
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10,0 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
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Abstract
English
Reversible post-translational modification with SUMO (small ubiquitin-related modifier) is an important mechanism to regulate the function, activity or localization of target proteins. Covalent attachment of SUMO requires an enzymatic cascade involving an E1, an E2 enzyme and in most cases an E3 ligase. Interestingly, one of the few well-characterized SUMO E3 ligases, RanBP2/Nup358, is a nuclear pore complex protein suggesting a connection between nuclear transport and SUMOylation. Prerequisite for following this assumption was to identify RanBP2-dependent SUMO substrates, since there was no physiological RanBP2 target known at the onset of this work. Here, we show that NFYA, a subunit of the trimeric transcription factor NF-Y, is a substrate for RanBP2-dependent SUMOylation both in vitro and in vivo. In a site-directed mutagenesis and mass spectrometry based approach, we systematically investigated SUMO-acceptor sites in NFYA. These studies led to the conclusion that possibly all nine existing lysine residues can be covalently linked with SUMO. The K283 SUMO-acceptor site is embedded in a classical SUMO consensus motif; further lysines can probably be linked to SUMO in dependence of a SUMO interaction motif (SIM). In order to assess the biological function of NFYA SUMOylation, we conducted binding studies revealing that NFYA can be modified only as a monomer, but neither in complex with its transport receptor importin β nor in context of the trimeric NF-Y complex. Furthermore, monomeric SUMOylated NFYA is visibly inhibited in its ability for complex formation with importin β or NFYB/C. Due to the impaired interaction of NFYA with its import receptor, it has been examined, whether SUMO modification affects the import as measured by in vitro transport reactions. Therefore, different YFP fusion proteins have been generated and their import rates were compared. Interestingly a faster import could be determined by a lysine-less and therefore non-SUMOylateble NFYA in comparison to the wild-type protein. SUMOylation of NFYA possibly decelerates protein import by impairing binding of NFYA to importin β.
Keywords: SUMO; NF-Y; nucleocytoplasmic transport
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Reversible posttranslationale Modifikation mit Ubiquitin-ähnlichen Proteinen der SUMO-Familie ist ein wichtiger Mechanismus, um Proteine in ihrer Funktion, Aktivität oder Lokalisation zu beeinflussen. Die kovalente Anheftung von SUMO erfordert das Zusammenspiel einer Enzymkaskade von einem E1, einem E2 Enzym und in den meisten Fällen einer E3 Ligase. Interessanterweise ist eine der wenigen bekannten SUMO E3 Ligasen, RanBP2/Nup358, ein Kernporenkomplexprotein. Dies legt eine Verbindung zwischen Kerntransport und SUMOylierung nahe. Um dieser Vermutung nachzugehen, mussten zunächst RanBP2-abhängige SUMO-Substrate identifiziert werden, da zu Beginn der Arbeit noch keine physiologischen RanBP2 Substrate bekannt waren. Dies gelang mit dem Nachweis, dass NFYA, eine Untereinheit des trimeren Transkriptionsfaktors NF-Y, sowohl in vitro als auch in vivo in Abhängigkeit von RanBP2 SUMOyliert wird. Systematische Untersuchungen zur Identifikation der SUMO-Akzeptorstelle im NFYA führten zu dem Schluss, dass möglicherweise alle neun vorhandenen Lysine mit SUMO verknüpft werden können. Eine SUMO-Akzeptorstelle (K283) ist in ein klassisches SUMO Konsensusmotiv eingebettet, weitere Lysine können höchstwahrscheinlich in Abhängigkeit eines SUMO-Interaktions-Motives (SIM) mit SUMO verknüpft werden. Funktionelle Studien zur Bedeutung der SUMOylierung zeigten, dass NFYA nur als Monomer, nicht aber im Komplex mit Importin β oder dem NFYB/C Heterodimer modifiziert werden kann. Nach SUMOylierung ist monomeres NFYA in seiner Fähigkeit zur Komplexbildung deutlich inhibiert. Aufgrund der verschlechterten Interaktion von NFYA mit seinem Importrezeptor sollte anschließend untersucht werden, ob die Modifikation mit SUMO den Import in in vitro Transport-Reaktionen beeinflusst. Hierzu wurden verschiedene YFP-Fusionsproteine hergestellt und deren Importraten verglichen. Interessanterweise konnte ein schnellerer Import von Lysin-freiem, also nicht SUMOylierbarem NFYA im Vergleich zum Wildtypprotein festgestellt werden. Möglicherweise verlangsamt die SUMOylierung den NFYA Proteinimport, indem sie die Bindung an den Importrezeptor beeinträchtigt.
Schlagwörter: SUMO; NF-Y; Kern-Zytoplasma-Transport
