Die Bedeutung von BRCA1-assoziiertem Protein in der Entwicklung der lastinduzierten Myokardhypertrophie

Abstract

Die Mitogen aktivierte Protein Kinase (MAPK)-Signalkaskade reguliert entscheidende zelluläre Prozesse wie Zellwachstum, Differenzierung, Mitose und Apoptose und spielt eine wesentliche Rolle bei der kardialen Signaltransduktion und Hypertrophieentwicklung. In Vorarbeiten konnte BRCA1 associated protein 1 (BRAP) im Rahmen einer Proteomstudie als ein Protein identifiziert werden, welches in einem Tiermodell der lastinduzierten Myokardhypertrophie differenziell reguliert wird. BRAP moduliert in immortalisierten Zelllinien die Ras-abhängige Signaltransduktion von Raf zu Mek.In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von BRAP in Kardiomyozyten in vitro und in vivo untersucht. Die Stimulation der Ras-Aktivität in Kardiomyozyten führte zu einer Verringerung der detektierten BRAP-Proteinmenge nach einer Stunde, übereinstimmend mit dem publizierten Mechanismus einer Ras-abhängig induzierten Autoubiquitinylierung und Degradation von BRAP. Zur Untersuchung der Wirkung von BRAP auf die Signaltransduktion in isolierten primären Kardiomyozyten wurde BRAP durch adenoviral vermittelten Gentransfer überexprimiert und die MAPK-Aktivierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass BRAP eine dosisabhängige Hemmung der C-Raf abhängigen Mek-Aktivierung bewirkt. In vivo bewirkte die Kardiomyozyten-spezifische Überexpression von BRAP in transgenen Mäusen den Phänotyp einer ausgeprägten dilatativen Kardiomyopathie verbunden mit einer deutlich verminderten Kontraktilität und erhöhter Mortalität im Modell der BRAP-transgenen Maus. Es konnte anhand einer erhöhten Konzentration an zytoplasmatischem Cytochrom C und eines erhöhten Bax/Bcl2-Verhältnis gezeigt werden, dass es bereits vor der Entstehung der exzentrischen Hypertrophie zu einem Verlust der Integrität der Mitochondrienmembran bei den BRAP-transgenen Mäusen kam. Zur Untersuchung der Auswirkung eines Fehlens und einer Verminderung von BRAP wurde anhand eines genetrap-ES-Zellklons ein knock out-Mausmodell generiert. Es konnte gezeigt werden, dass BRAP essentielle Funktionen während der Embryonalentwicklung besitzt, da homozygote BRAP knock out Embryonen zwischen E9,5 und E10,5 sterben. Am Tag E9,5 weisen homozygote BRAP knock out Embryonen häufig eine verminderte Größe und teilweise ein verzögertes Entwicklungsstadium auf.Mittels 2D-Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse konnte ein komplexes Muster posttranslationaler Modifikationen von BRAP gezeigt werden. Durch Immunpräzipitation von überexprimiertem BRAP und Massenspektrometrie konnten zehn verschiedene phosphorylierte Peptide von BRAP identifiziert werden, anhand derer auf mindestens zehn Phosphorylierungsstellen geschlossen werden kann. Insgesamt zeigen die erhobenen Daten, dass BRAP ein bedeutendes, komplex reguliertes Protein ist, dem eine wichtige Bedeutung bei der MAPK-Signaltransduktion im Herzen und während der Embryonalentwicklung zukommt.