Characterisation of the cell wall protein Pga29p in the human pathogenic fungus Candida albicans
Charakterisierung des Zellwandproteins Pga29p in dem human pathogenen Pilz Candida albicans
von Albert Daniël de Boer
Datum der mündl. Prüfung:2009-01-19
Erschienen:2009-02-17
Betreuer:PD Dr. Michael Weig
Gutachter:Prof. Dr. Uwe Groß
Gutachter:PD Dr. Wilfried Kramer
Gutachter:Prof. Dr. Ivo Feußner
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Candida albicans is an opportunistic fungal pathogen that is responsible for most of the Candida infections in humans. It can cause superficial infections on the mucosa, nails or skin and in severely immunocompromised individuals it is able to disseminate via the bloodstream and infect deep tissues, which can lead to life-threatening situations. In order to improve the treatment against C. albicans infections, a thorough understanding of the pathogenesis on a molecular level is needed. The last two decades, the cell wall of C. albicans has been an interesting object of research for investigators around the world, mainly because this structure is not present in mammalian cells and therefore it is a potential drug target. Moreover, the upper layer of the cell wall consists of mannoproteins that play an important role in the infection process of C. albicans. In this study we characterised Pga29p (Predicted GPI-anchored protein 29), a small yeast-specific protein, that is covalently linked to the beta-1,3-glucan framework of the cell wall via beta-1,6-glucan. The protein is abundantly present in the wall of yeast cells, but its covalent incorporation drastically decreases upon the yeast-to-hyphae transition. Deletion of PGA29 did not result in altered chitin or protein levels in the cell wall. However, the mannose/glucose ratio was significantly decreased, suggesting a reduced mannan level in in pga29/pga29 cell walls. The pga29/pga29 strain did not show differences in growth characteristics or sensitivity to cell wall stresses and antimycotics compared with the control strains. Subsequently the full cell wall proteome of the pga29/pga29 deletion mutant was analysed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). The resulting data indicated that PGA29 deletion is not compensated by cell wall incorporation of the family members Pga30p and Pga31p or other CWPs, suggesting that Pga29p does not play a major role in maintaining the cell wall integrity of C. albicans. In two independent virulence models, a mouse model of systemic infection and the reconstituted human epithelium (RHE) oral model, the pga29/pga29 strain showed a reduction in virulence. As PGA29 is downregulated in the hyphal form, the protein seems to be involved in the very initial, yeast-morphology based stages of infection. However, the diminished virulence of the pga29/pga29 strain seemed not to be based on an altered adhesion capacity or a reduced ability to form hyphae. As cell wall mannans are known as important pathogen associated molecular patterns (PAMPs), further experiments were conducted to investigate whether the reduced mannan in the pga29/pga29 strain could be responsible for altered host cell interactions which may lead to the observed reduced virulence. O-mannosylation of Pga29p by protein-O-mannosyltransferase 1 (Pmt1p) was proven by analysis of CWP extracts from C. albicans mutants that are deficient in O-glycosylation. RHE infected with the pga29/pga29 strain showed a reduced expression of proinflammatory cytokines. This diminished immune response could be related with the decrease of mannan in the cell wall or the reduced tissue damage that was caused by pga29/pga29 strain. However, upon stimulation with pga29/pga29 mutants, murine primary dendritic cells (mDCs) and human polymorphonuclear leukocytes (PMNs) did not show altered cytokine or oxidative burst levels, respectively. These results indicate that the reduced virulence may not be related to an altered host-pathogen cross-talk via the mannans. We propose that Pga29p is involved in the initial stage of infection, prior to hyphae development, which designates this protein as the first yeast-specific CWP of C. albicans that directly plays a role in virulence.
Keywords: Candida albicans; cell wall; GPI-protein; virulence factors
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Candida albicans ist ein opportunistischer humanpathogener Pilz, der für die meisten Candida-Infektionen beim Menschen verantwortlich ist. Er kann oberflächliche Infektionen auf der Schleimhaut, den Nägeln oder der Haut verursachen. In immuno-defizienten Einzelpersonen kann sich C. albicans über den Blutstrom verbreiten und invasiv Gewebe infizieren, was zu lebensbedrohenden Situationen führen kann. Um die Behandlung von C. albicans Infektionen zu verbessern, ist ein vollständiges Verständnis der Pathogenese auf einem molekularen Niveau erforderlich. In den letzten zwei Dekaden war die Zellwand von C. albicans ein zentrales Thema der Pilz-Forschung, hauptsächlich weil diese essentielle Struktur nicht in Säugetierzellen vorkommt und dadurch ein mögliches Ziel zur Antimykotikaentwicklung darstellt. Außerdem besteht die obere Schicht der Zellwand aus Mannoproteinen, die eine wichtige Rolle im Infektionsprozeß von C. albicans spielen. In der vorgelegten Arbeit charakterisieren wir Pga29p (Predicted GPI-anchored protein 29), ein kleines Hefe-spezifisches Protein, das kovalent an dem beta-1,3-Glukanskelett über beta-1,6-Glukan mit der Zellwand verbunden wird. Das Protein ist in der Wand der Hefezellen reichlich anwesend, aber die kovalente Einbindung nimmt bei dem Hefe-zu-Hyphe Übergang stark ab. Die Deletion von PGA29 induziert keine Änderungen im Chitin oder in dem Proteinniveau der Zellwand. Jedoch ist das Mannose/Glukose Verhältnis signifikant reduziert. Dies deutet darauf hin, dass der Mannangehalt in den Zellwänden der pga29/pga29 Mutante vermindert ist. Der pga29/pga29 Stamm zeigte dagegen keine Unterschiede im Wachstum, der Empfindlichkeit gegenüber Zellwandstress und gegen diverse Antimykotika im Vergleich mit den Kontrollestämmen. Mit dem Ziel kompensatorische Veränderungen in der Mutante aufzuzeigen, wurde das ganze Zellwandproteom der pga29/pga29 Deletionsmutante mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) analysiert. Die resultierenden Daten deuten an, dass die Deletion von PGA29 nicht durch einen verstärkten Einbau der Homologen Pga30p und Pga31p oder anderer Zellwandproteine (CWPs) kompensiert wird. Pga29p scheint daher keine tragende Rolle für die Zellwandintegrität von C. albicans zu spielen. In zwei unabhängigen Virulenzmodellen, einem Mäusemodell für systemische Infektion und einem humanen oralen Epithel Modell (RHE), zeigte die pga29/pga29 Mutante eine reduzierte Virulenz auf. Die nachgewiesene Herabregulation von PGA29 während des Hefe-zu-Hyphe Übergangs legt daher nahe, dass das Protein am Anfang des Infektionsprozesses beteiligt ist. Jedoch konnte gezeigt werden, dass die verminderte Virulenz nicht mit einer geänderten Adhäsionskapazität oder einer verringerten Fähigkeit Hyphen zu bilden korreliert ist. Da die Zellwandmannane wichtige pathogen associated molecular patterns (PAMPs) darstellen, wurden weitere Experimente ausgeführt, um die Frage zu beantworten, ob das verringerte Mannan in der pga29/pga29 Mutante für geänderte Wirtszelleinteraktionen verantwortlich sein könnte. Eine O-Mannosylierung von Pga29p durch die Protein-O-mannosyltransferase 1 (Pmt1p) wurde durch Analyse von CWP-Extrakten von C. albicans Mutanten, die defizient sind in ihrer O-Glykosylierung, nachgewiesen. RHE, welches mit dem pga29/pga29 Stamm infiziert wurde, zeigte eine verringerte Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen. Diese verminderte Immunantwort könnte mit der Abnahme des Mannans in der Zellwand zusammenhängen. Ein anderes Erklärungsmodell der veränderten Immunantwort wäre der verringerte Gewebeschaden der durch die pga29/pga29 Mutante verursacht wird. Jedoch zeigten primäre dendritische Zellen (mDCs), die aus der Maus isoliert wurden und auch menschliche polymorphonukleare Leukozyten (PMNs) keine geänderten Zytokinmuster oder veränderte Niveaus des oxidativen Bursts nach Stimulierung mit der pga29/pga29 Mutante. Die beobachtete verringerte Virulenz der Mutante scheint daher nicht mit einem geänderten Wirts-Pathogen cross talk basierende auf der Reduktion der Mannane zusammenzuhängen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Pga29p im Anfangsstadium der Infektion (noch vor der Hyphenentwicklung) beteiligt ist ist und damit das erste Hefe-spezifische CWP von C. albicans darstellt welches eine direkte Rolle in der Virulenz spielt.
Schlagwörter: Candida albicans; Zellwand; GPI-protein; Virulenzfaktoren