Purification and crystallization of spliceosomal snRNPs

Abstract

In Eukaryoten werden die nicht-kodierenden Sequenzen des prä-mRNA-Transkripts durch einen Ribonukleoproteinkomplex, das Spleißosom, entfernt. Die Hauptkomponenten des Spleißosoms sind die Ribonukleoproteinpartikel (snRNPs) U1, U2, U4, U5 und U6. Neben der U1 small nuclear RNA (snRNA) enthält das U1 snRNP drei partikel-spezifische Proteine, U1-A, U1-70k und U1-C. Des weiteren findet man einen Satz von sieben Proteinen, den Sm-Proteinen, die auch in anderen snRNPs vorkommen und eine ringähnliche Struktur, den Sm core, ausbilden. U2 snRNP ist mit zwei Multiproteinfaktoren, SF3a und SF3b, assoziiert und formt so den 17S U2 snRNP. Der Faktor SF3a besteht aus drei Proteinen, SF3a 60, 66 und 120. Die snRNPs U4, U5 und U6 bilden den 25S U4/U6 U5 tri-snRNP mit 36 Proteinen und drei RNAs. Mithilfe verschiedener Techniken wie Elektronenmikroskopie, Röntgenkristallographie und NMR konnten erste Substrukturen dieses Komplexes gelöst werden. Um fundamentale Einsichten in den Spleißmechanismus zu gewinnen, ist die atomare Auflösung der Strukturen von SF3a, tri-snRNP und U1 snRNP notwendig. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die Präparation von U1, tri-snRNP und SF3a für die Röntgenkristallographie zu optimieren, sowie die Lösung der Strukturen zu ermöglichen.In der hier vorgelegten Arbeit wurden SF3a und tri-snRNP aus HeLa-Zellen gereinigt, konzentriert und Kristallisationsansätzen zugeführt. Da HeLa tri-snRNP instabil gegenüber Ultrafiltration oder Pelletierung war, wurde die Konzentration dieses Partikels durch Fällung mit Ammoniumsulfat und anschließender Mikrodialyse erreicht. So konnte hochkonzentrierter und stabiler tri-snRNP gewonnen und den Kristallisationsansätzen zugeführt werden. Das Wachstum von U1 snRNP-Kristallen wurde zuvor beobachtet, war jedoch nicht reproduzierbar. Diese Kristalle hatten eine geringe Auflösung von 20 Å. Die Zugabe von Proteasen zu den Kristallisationsansätzen gewährleistete ein reproduzierbares Wachstum der Kristalle. Eine Analyse der gelösten Kristalle ergab, daß die Proteolyse mehrerer Proteine von U1 snRNP eine Voraussetzung für Kristallwachstum war. Ferner wurde das Reinigungsprotokoll von U1 snRNP durch eine vollständige Trennung der Partikel von U2 snRNP verbessert. Dies erlaubte eine Kombination von Hochdurchsatzkristallisationsansätzen mit in situ Proteolyse in Gegenwart von diversen Liganden von U1 snRNP. Diese kombinierten Strategien führten zur Herstellung von U1 snRNP-Kristallen, die bis zu einer Auflösung von 4 Å streuten. Komplette Datensätze bis zu einer Auflösung von 4,5 Å von U1 snRNP-Kristallen mit einem DNA-Oligonukleotid als 5 splice site-Mimikry konnten so gewonnen werden. Ferner konnten initiale Phaseninformationen für diese Kristalle bestimmt werden. Drei Schweratomderivate wurden bei niedriger Auflösung charakterisiert. Durch molecular replacement wurde eine potentielle und partielle Lösung der Struktur gefunden, die U1-A und ein synthetisches Modell des Sm core enthält. Die verschiedenen Ansätze der Phasierung der Struktur konnten durch Kreuzvalidieren bestätigt werden. Diese Ergebnisse liefern einen Ausgangspunkt für die Strukturlösung von U1 snRNP mit atomarer Auflösung.