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Characterizing the RanGAP1-RanBP2 complex in mitosis

dc.contributor.advisorMelchior, Frauke Prof. Dr.de
dc.contributor.authorFlotho, Annettede
dc.date.accessioned2012-04-16T14:52:16Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:49Zde
dc.date.issued2009-03-18de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD39-Cde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-328
dc.description.abstractDer RanGAP1-RanBP2 Komplex stellt ein faszinierendes makromolekulares Gebilde dar, welches mindestens zwei enzymatische Aktivitäten umfasst. Zum einen beinhaltet der Komplex die GTP-Hydrolyse aktivierende Funktion, die RanGAP1 zusammen mit RanBP2 ausübt, zum anderen besitzt RanBP2 zusammen mit Ubc9 Sumo-konjugierende Aktivität. Gemeinsam sind diese Proteine essentielle Regulatoren des nukleo-zytoplasmatischen Transportes in Interphasezellen, und spielen des Weiteren eine wichtige, bislang jedoch kaum verstandene Rolle für die Funktion der Kinetochore in Mitose.Um den RanGAP1-RanBP2 Komplex spezifisch in mitotischen Zellen näher zu untersuchen, habe ich spezifisch in Mitose nach Interaktionspartnern gesucht. Dies führte zur Identifikation des Kernexportrezeptors Crm1 und der GTPase Ran als stabile Komponenten in einem Komplex mit RanGAP1, RanBP2 und Ubc9 in mitotischen Zellen. Zusätzlich schien dieser Komplex zahlreiche weitere Proteine in substöchiometrischen Mengen zu enthalten. Diese könnten beispielsweise NES-enthaltende Interaktionspartner von Crm1 und/oder Substrate für RanBP2-abhängige Sumoylierung sein. Da bisher RanBP2-abhängige Sumo-Substrate weitgehend unbekannt sind, habe ich eine Strategie entwickelt, um sumoylierte Proteine aus immungereinigtem RanGAP1-RanBP2 Komplex anzureichern. Dies ermöglichte die massenspektrometrische Identifizierung von ungefähr 90 potentiellen Sumo-Substraten, die spezifisch in mitotischen RanGAP1 Komplexen angereichert waren; 6 dieser Substrate wurden zur weiteren Charakterisierung ausgewä! hlt. Alle Kandidaten assoziierten mit mitotischen RanGAP1 Komplexen (Topo II alpha, TACC2, CKAP-5, Plk1, USP7, PIAS1). Die meisten davon konnten entweder in vitro mit rekombinanten Faktoren (TACC2, Plk1) oder als endogene Proteine, die mit mitotischem RanGAP1-RanBP2 Komplex als Quelle der Sumo E3 Ligase-Aktivität assoziiert waren (TopoII alpha, Plk1, USP7), sumoyliert werden. Auffällig war die Co-Reinigung der Sumo E3 Ligase PIAS1 mit RanGAP1 aus mitotischen Zellen; diese wurde ebenfalls effizient sumoyliert. Weitere Analysen deuteten darauf hin, dass RanGAP1 in einem Komplex mit PIAS1 enthalten ist, der sich vom RanGAP1-RanBP2 Komplex unterscheidet.In einem Nebenprojekt konnte ich zeigen, dass das Sumo-konjugierende Enzym Ubc9 in Zellen an Lysin 14 sumoyliert werden kann. Dieser Befund war wichtig, um eine biochemische Studie von Knipscheer et al. zu ergänzen, die einen neuen Mechanismus der Selektion von Sumo-Substraten identifizierte; diese Ergebnisse flossen in die Veröffentlichung Knipscheer, Flotho, Klug et al. (2008) Mol Cell ein.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleCharacterizing the RanGAP1-RanBP2 complex in mitosisde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedCharakterisierung des RanGAP1-RanBP2 Komplexes in Mitosede
dc.contributor.refereeMelchior, Frauke Prof. Dr.de
dc.date.examination2008-10-30de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengThe RanGAP1-RanBP2 complex represents a fascinating macromolecular assembly comprising at least two enzymatic activities. On one hand, it harbors the GTP hydrolysis activating function of RanGAP1 together with RanBP2, and on the other hand, RanBP2 in concert with Ubc9 contains Sumo conjugating activity. Together, these proteins are not only crucial regulators of nucleocytoplasmic transport in interphase cells but they also play an important yet ill-defined role in kinetochore function during mitosis.To gain insight into the RanGAP1-RanBP2 complex specifically in mitotic cells, I searched for mitosis-specific interaction partners. This led to the identification of the nuclear export receptor Crm1 and the GTPase Ran as stable components in complex with RanGAP1, RanBP2 and Ubc9 in mitotic cells. In addition, the complex seemed to contain many different proteins at substochiometric levels. These could, for example, be NES containing Crm1 interactors and/or targets for RanBP2 dependent sumoylation. As RanBP2 dependent Sumo targets are largely unknown, I devised a strategy to enrich sumoylated proteins from immunoprecipitated RanGAP1-RanBP2 complexes. This allowed mass-spectrometric identification of 90 putative Sumo substrates specifically enriched in mitotic RanGAP1 complexes; 6 of these were selected for further validation. All candidates associated with mitotic RanGAP1 complexes (Topo II alpha, TACC2, CKAP-5, Plk1, USP7, PIAS1), and most of these could be sumoylated in vitro with recombinant factors (TACC2, Plk1) or as proteins associated with mitotic RanGAP1-RanBP2 complexes as source of Sumo E3 ligase activity (TopoII alpha, Plk1, USP7). Strikingly, the Sumo E3 ligase PIAS1 also co-purified with RanGAP1 from mitotic cells and was efficiently sumoylated in these experiments. Further analysis suggested that mitotic RanGAP1 is present in a complex with PIAS1 distinct from the RanGAP1-RanBP2 complex.In a side project, I could show that the Sumo conjugating enzyme Ubc9 is sumoylated on lysine 14 in cells. This finding was crucial to supplement a biochemical study by Knipscheer et al. that identified a novel mechanism for Sumo substrate selection and contributed to the publication Knipscheer, Flotho, Klug et al. (2008) Mol Cell.de
dc.contributor.coRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerRanGAP1de
dc.subject.gerRanBP2de
dc.subject.gerUbc9de
dc.subject.gerCrm1de
dc.subject.gerRande
dc.subject.gerSumode
dc.subject.engRanGAP1de
dc.subject.engRanBP2de
dc.subject.engUbc9de
dc.subject.engCrm1de
dc.subject.engRande
dc.subject.engSumode
dc.subject.bk42.13de
dc.subject.bk42.15de
dc.subject.bk35.70de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2060-7de
dc.identifier.purlwebdoc-2060de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 200: Molekularbiologiede
dc.subject.gokfullWHF 500: Zellteilung {Cytologie}de
dc.identifier.ppn661849538de


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