HIV-1 Nef destabilisiert artifizielle Membransysteme: Untersuchung der Bedeutung des Myristoylankers und des positiven Ladungsclusters

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Interaktion des HIV-1 Nef Pro-teins mit artifiziellen Membransystemen. In der Literatur wurde in den 1990ern postu-liert, dass der N-terminale Lipidanker für die Wechselwirkung des Proteins mit Membra-nen essentiell ist. Allerdings wurden in letzter Zeit Studien veröffentlicht, die zeigen, dass auch das unmyristoylierte Protein mit Membranen assoziiert sein kann. Somit muss es noch andere Strukturmotive geben, die die Wechselwirkung maßgeblich beeinflussen. Daher wurde in dieser Arbeit zum einen der Einfluss des N-terminalen Myristoylankers untersucht und zum anderen der Einfluss des positiven Ladungsclusters im N-Terminus des Proteins. Hierzu wurden neben den Messungen mit wt Nef auch Messungen mit der unmyristoylierten Mutante Nef G2A sowie mit Mutanten mit reduzierter positiver La-dungsdichte Nef KKAA und Nef R4A durchgeführt. Überraschenderweise konnte sowohl bei Experimenten an unilamellaren Lipidvesikeln als auch bei Experimenten mit festkörperunterstützten Lipiddoppelschichten keine Bindung des Proteins an Membranen beobachtet werden. Vielmehr lassen die Untersuchungen darauf schließen, dass das Protein in der Lage ist, die Stabilität von Lipid-doppelschichten zu stören und Lipide aus dem Membranverbund herauszulösen. Dies zeigte sich bei den Release-Messungen in einer Freisetzung des Farbstoffs 5(6)-Carboxyfluorescein. Bei den QCM-Experimenten konnte eine Anstieg der Resonanzfrequenz der Schwingquarzes und bei den Ellipsometriemessungen eine Verringe-rung der Schichtdicke des Membransystems beobachtet werden. Mittels der hochauflösenden bildgebenden Methoden Fluoreszenz- und Rasterkraftmikroskopie konnte diese Störung der Struktur von Lipiddoppelschichten visualisiert werden. Durch den Einsatz eines FITC-konjugierten Antikörpers konnte gezeigt werden, dass HIV-1 Nef in den ge-störten Bereichen der Membran lokalisiert ist. Mittels rasterkraftmikroskopischer Unter-suchungen konnte das Protein ebenfalls in den Membrandefekten visualisiert werden. Abgeseh en von den Release-Messungen mit der Lipidmischung POPC:POPS (4:1) zeigte sich bei den Experimenten, dass der N-terminale Lipidanker des Proteins die Interaktion mit artifiziellen Membranen nicht maßgeblich beeinflusst. Sowohl an Lipidvesikeln als auch an festkörperunterstützten Membranen lagen die von Nef G2A induzierten Störun-gen in der Organisation der Lipiddoppelschichten in der gleichen Größenordnung wie die von wt Nef verursachten. Eine Verringerung des positiven Ladungsclusters im N-Terminus des Proteins beeinflusst die Wechselwirkung mit Membranen stark. Dies zeigten die Untersuchungen mit den Mutanten Nef KKAA und Nef R4A. Diese Mutanten destabilisierten die untersuchten Membransysteme in viel geringerem Umfang als wt Nef. Die Mutanten Nef KKAA führte dabei noch zu einer etwas größeren Störung der Mem-branstruktur als Nef R4A. Dies könnte zum einen darin begründet sein, dass Nef KKAA im Gegensatz zu Nef R4A mit nur noch 3 positiven Ladungen noch 5 positive Ladungen besitzt, zum anderen könnte es auch zeigen, dass die N-terminalen Arginine eine wichtigere Rolle bei der Wechselwirkung mit Membranen spielen als die Lysine. In Rahmen dieser Arbeit wurde ebenfalls der Einfluss der Lipidzusammensetzung von Membranen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass das Einbringen von negativer Ladungsdichte in die Membranen zu einer Verringerung der Aktivität des Proteins führt. Allerdings scheint vor allem bei wt Nef mehr die Struktur der Kopfgruppe des Lipids die Interaktion zu beeinflussen als die Ladung selbst.