Studien zur Ansamitocin-Biosynthese sowie Sekundärstoffproduktion durch mikrobielle Interaktion
Investigations on the Biosynthesis of Ansamitocin and Production of Secondary Metabolites by microbial Interaction
by Nadine Czempinski
Date of Examination:2007-10-31
Date of issue:2009-06-23
Advisor:Prof. Dr. Axel Zeeck
Referee:Prof. Dr. Axel Zeeck
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
This thesis is structured in four separate sections. The main part is about biosynthetic investigations of Ansamitocin, a high-potent antitumor agent belonging to the family of the maytansins. One part of the investigations was heterologous expression of different diketide precursors of the ansamitocin P-3 in Corynebacterium glutamicum. With experiments by feeding different putative precursor molecules starter units of the ansamitocin some diketide products could be detected by HPLC-ESI-MS. A further part of the biosynthetic investigation was performed by precursor-directed biosynthesis. Feeding various putative precursor molecules to the culture broth of the Actinosynnema pretiosum mutant strain HGF073 led to the preparative isolation and purification of 20-Demethoxyansamitocin. Within this thesis a sufficient amount of the 20-Demethoxy-derivative was isolated for analytical investigations and various tests on biological activity in comparison to AP-3.The second topic of this thesis is about the strain Kitasatospora putterlickiae F98-18 (AK LEISTNER, Bonn). This was isolated from maytansin producing plants and exhibits a new metabolite by interaction with the mold fungus Mucor sp. During comprehensive attempts of isolation strategies we found decomposition of this new metabolite. Analysis of one of those reaction products led to anthranilic acid.Within the third section of this thesis investigations of the strain Streptomyces antimycoticus FZB53 (E. KOCH, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA), Darmstadt) we performed. The strain showed very strong activity against several bacteria and fungi. Isolation of the active compound led surprisingly to two different substances: A polyether belonging to the family of nigericins and geldanamycin.The fourth part shows investigations on the effect of the fungus Piriformospora indica on root growth of plants. Interaction of that fungus with Arabidopsis thaliana led to branched and bushy root growth. Analysis of different culture broth extracts of Piriformospora indica carried out the active and responsible metabolite, the plant hormone auxin.
Keywords: ansamitocin; biosynthesis; PKS; auxin; nigericin; diketide; microbial interaction
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Die vorliegende Arbeit ist in vier Themenabschnitte gegliedert. Das Hauptaugenmerk befasst sich mit Biosyntheseuntersuchungen zum Ansamitocin, einem hochpotenten, cytostatischen Naturstoff der Maytansinfamilie. Zum Einen erfolgte heterologe Expression verschiedener Diketidvorläufer des Ansamitocin P-3 in Corynebakterium glutamicum. Mittels Fütterungsexperimenten unter Verwendung stammeigener sowie stammfremder Startereinheiten des Ansamitocins konnten einige Diketide per HPLC-ESI-MS nachgewiesen werden. Zum Anderen war die Vorläufer-dirigierte Biosynthese durch Fütterung verschiedener stammfremder Biosynthesevorläufer zum 20-Desmethoxyansamitocin mit der Actinosynnema pretiosum-Knockout-Mutante HGF073 ein Teil der Untersuchungen zur Ansamitocin-Biosynthese. Dieses Derivat konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals durch Optimierung der Fermentations-, Fütterungs- und Isolierungsmethoden in ausreichender Menge für umfassende analytische Zwecke bereitgestellt und die biologische Aktivität vergleichend zum Ansamitocin P-3 getestet werden.Ein zweiter Themenbereich dieser Arbeit befasst sich ebenfalls mit der Substanzklasse der Maytansine. Der aus einer maytansinproduzierenden Pflanze isolierte Stamm Kitasatospora putterlickiae F98-18 (AK LEISTNER, Bonn) reagiert bei Interaktion mit dem Schimmelpilz Mucor sp. mit der Produktion eines neuen Metaboliten. Bei den umfassenden Isolierungsarbeiten zeigte sich ein rascher Zerfall dieses neuen Metaboliten. Als offensichtliches Zerfallsprodukt konnte Anthranilsäure identifiziert werden.Der dritte Zweig dieser Arbeit besteht aus Untersuchungen des Stammes Streptomyces antimycoticus FZB53 (überlassen von E. KOCH, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA), Darmstadt), der in einem Screeningprogramm der BBA gegen verschiedene phytopathogene Bakterien und Pilze aufgrund seiner starken Aktivität aufgefallen ist. Die Isolierung des aktiven Prinzips ergab nach Fermentationsvariation überraschenderweise zwei Substanzen: Einen Polyether aus der Nigericin-Familie sowie Geldanamycin.Ein viertes Themengebiet dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Wirkung des Pilzes Piriformospora indica auf Pflanzen, welcher in Studien (AK KARLOVSKY) ein verzweigtes Wurzelwachstum der Modellpflanze Arabidopsis thaliana ausgelöst hat. Als verantwortlicher Metabolit konnte mithilfe von MS-Analyse der Pilz-Kulturfiltrat-Extrakte das Pflanzenhormon Auxin nachgewiesen werden.
Schlagwörter: Ansamitocin; Biosynthese; PKS; Auxin; Nigericin; Diketide; mikrobielle Interaktion