Hochohmige porenüberspannende Lipidmembranen: Elektrochemische Untersuchungen zur Aktivität von Gramicidin und Bacteriorhodpsin

Abstract

In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Präparation von porenüberspannenden Lipidmembranen entwickelt, nach der lösungsmittelfreie, hochohmige Lipiddoppelschichten erstmals durch die Fusion von Vesikeln auf einer porösen Oberfläche erhalten werden konnten. Dies eröffnete die Möglichkeit, durch den Einsatz von Proteoliposomen porenüberspannende Membranen mit hoher Proteindichte herzustellten. Auf Cholesterylpolyethylenoxythiol (CPEO3)-funktionalisierten porösen Aluminaten mit Poren von 60 nm Durchmesser sowie ohne bzw. mit verbleibendem Barriereoxid in der Randregion konnten hochohmige Lipiddoppelschichten erhalten werden. Für die mittels Impedanzspektroskopie untersuchten Lipidmembranen konnten elektrische Modelle entwickelt werden, welche die genaue Beschreibung der Membraneigenschaften zuließen. Die porenüberspannenden Membranen waren über mehrere Tage stabil. Membrandefekte konnten durch die Zugabe von Vesikeln wieder aufgefüllt werden. Gegenüber hohen Ionenkonzentrationen waren die porenüberspannenden Membranen relativ dicht, konnten durch das Detergenz Octylpolyoxyethylen (o-POE) jedoch leicht, wenngleich reversibel, permeabilisiert werden. Das Porin OmpF konnte in hoher Dichte aus der Elektrolytlösung in die Membranen rekonstituiert werden. Porenüberspannende Membranen auf porösem Silizium mit Poren bis zu 2 µm konnten in rasterkraft- und fluoreszenzmikroskopischen Experimenten visualisiert werden. In Kraft-Indentations- und fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)-Experimenten wurde gezeigt, dass die Membranen elastisch sind und die Lipide eine vergleichweise hohe laterale Mobilität besitzen. Lipidmembranen auf Goldelektroden dienten als Vergleichssystem, das insbesondere zur Aufklärung der Abstandhalterfunktion von CPEO3 beitrug. Gramicidin D konnte aus Proteoliposomen in hoher Dichte in porenüberspannende Membranen transferiert werden. Es konnten charakteristische Eigenschaften wie die Selektivität für Alkalikationen und die Blockade durch Ca2+ in impedanzspektroskopischen Untersuchungen bestätigt werden. Zudem konnte der durch niedrige Elektrolytkonzentrationen bedingte Massentransport mittels eines elektrischen Modells erfasst werden. Die Protonenpumpaktivität von Bacteriorhodopsin deutete auf eine funktionelle Integration des Proteins aus Proteoliposomen in die porenüberspannenden Membranen hin. Daneben lieferten eine Korrelation zwischen Impedanzdaten und Photostromexperimenten an porenüberspannenden und festkörpergestützten Membranen sowie simulierte Protonenpumpströme nach Membranmodellen Hinweise auf den Membranbildungsprozess. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Sensitivität der porenüberspannenden Membranen gegenüber dem membranlöslichen Protonencarrier Carbonyl-cyanid-m-chloro-phenylhydrazon (CCCP) sehr groß ist.