Zur Kurzanzeige

Laterale Organisation von Shiga Toxin gebunden an Gb3-haltige Modellmembranen

dc.contributor.advisorSteinem, Claudia Prof. Dr.de
dc.contributor.authorWindschiegl, Barbarade
dc.date.accessioned2009-07-15T15:08:24Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T10:32:08Zde
dc.date.available2013-01-30T23:51:22Zde
dc.date.issued2009-07-15de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD41-7de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-2033
dc.description.abstractIm Rahmen dieser Arbeit wurde die laterale Organisation der Untereinheit B von Shiga Toxin (STxB) gebunden an artifizielle Gb3-haltige Membransysteme untersucht. Mittels hochauflösender Rasterkraft (SFM)- und Fluoreszenzmikroskopie konnte die Bindung des Proteins an planare Lipidmono- und Lipiddoppelschichten und die Organisation der Lipide in den Membranen visualisiert werden. Die Bindung von STxB an festkörperunterstützte Lipiddoppelschichten, zusammengesetzt aus 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)/Sphingomyelin/Cholesterin/Gb3 (40:35:20:5), in denen eine flüssig-ungeordnete (ld ) und eine flüssig-geordnete Phase (lo Phase) koexistieren, wurde charakterisiert. Durch topographische SFM-Untersuchungen konnte die Bildung von 2,2 nm hohen STxB-Clustern, gebunden an Gb3 in der lo Phase, beobachtet werden. In DOPC/Gb3 (95:5) und DOPC/Cholesterin/Gb3 (65:30:5)-Doppelschichten, die keine erkennbare Phasenseparation aufwiesen, konnten ebenfalls 2,2 nm hohe STxB-Cluster auf der Membranoberfläche detektiert werden. Da die ermittelte Höhe der Proteincluster etwa 10 % größer ist als die aus der Kristallstruktur abgeleitete Höhe, wurde auf eine Anreicherung von Gb3-Lipiden, die zu einer erhöhten Membrandicke unterhalb der STxB-Cluster führen, geschlossen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung der Membrandicke durch die Bindung von Gb3 an die dritte Bindungsstelle (Site III) des STxB induziert wird, wie topographische Messungen mit dem mutierten Protein STxB-W34A, bei der die Funktion der Gb3-Bindung an Site III blockiert ist, gebunden an DOPC/Cholesterin/Gb3 (65:30:5)-Membranen, zeigten. Die Proteincluster waren nur 1,6 nm hoch. Mittels fluoreszenzmarkierter Membranen konnte eine Reorganisation der Lipide in DOPC/Sphingomyelin/Cholesterin/Gb3 (40:35:20:5)-Lipiddoppelschichten, induziert durch die STxB-Bindung, beobachtet werden. Mittels detaillierter Pixelanalyse konnte eine Erhöhung des Flächenanteils der ld Phase, sowie der Circularität der Lipiddomänen ermittelt werden. Weiterhin konnte eine Umverteilung des Fluorophors Perylen, der sich mit wachsendem Lateraldruck der Membran in fluiden Bereichen anreichert, von der lo in die ld Phase beobachtet werden. Aus den Resultaten wurde eine Erhöhung der Lipidpackungsdichte unterhalb der Proteincluster durch die Bindung von STxB an Gb3 gefolgert. In dieser Arbeit konnte außerdem der Einfluss des Sättigungsgrades der Gb3 Fettsäuren auf die Anordnung des membrangebundenen STxB und die Reorganisation der Lipide induziert durch die Proteinbindung geklärt werden. So zeigten rasterkraft- und fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen von DOPC/Sphingomyelin/Cholesterin/Gb3 (C22:113) (40:35:20:5)-Membranen eine nahezu komplette Belegung der Oberfläche mit gebundenem STxB im Gegensatz zur Lokalisation von STxB in der lo Phase bei Gb3 (C22:0)-haltigen Doppelschichten. Weiterhin wurde die Bindung von STxB an Gb3-haltige Lipidmonoschichten an der Wasser-Luft-Grenzfläche untersucht, um die Lipidreorganisation und Änderungen der Lipidpackungsdichte an einem dynamischeren Membransystem mittels Fluoreszenz-mikroskopie zu charakterisieren. In Lipidmonoschichten bestehend aus DOPC/Sphingomyelin/Cholesterin/Gb3, die vor Proteinbindung die Koexistenz von ld/lo Phase oder keine detektierbare Phasenseparation aufwiesen, konnte die Induzierung einer kondensierten Gb3-reichen Phase durch die STxB-Bindung beobachtet werden. Auf Basis der erhaltenen Ergebnisse wurde postuliert, dass in einem ersten Schritt STxB an die Membranoberfläche bindet und Proteincluster bildet. Weitere Gb3-Moleküle binden an die dritte Bindungsstelle von STxB, was zu einer Reorganisation und einer erhöhten Lipidpackungsdichte führt. Durch eine dicht gepackte Anordnung steigt die Linienspannung an der Grenzfläche der Cluster an, was zu einer Erhöhung der Circularität oder der Fusion von STxB-Gb3-Clustern führen kann. Außerdem ist die Bildung von Membrandeformationen denkbar, was die kürzlich durch STxB-Bindung beobachtete Bildung von Membraninvaginationen in Giant Unilamellar Vesicles erklären könnte. Der vorgeschlagene Mechanismus für die STxB-Bindung an Membranen liefert Einblicke in die in Zellen beobachtete Clathrin-unabhängige Endozytose.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleLaterale Organisation von Shiga Toxin gebunden an Gb3-haltige Modellmembranende
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedLateral Organisation of Shiga Toxin Bound to Model Membranes Containing Gb3de
dc.contributor.refereeSalditt, Tim Prof. Dr.de
dc.date.examination2009-01-23de
dc.subject.dnb540 Chemiede
dc.description.abstractengThe aim of this study was to elucidate lateral organization of bound STxB (Shiga Toxin, B-subunit) and the reorganization of lipids upon protein binding by means of high-resolution scanning force (SFM) and fluorescence microscopy. The formation of 2.2 nm high STxB-clusters was observed upon binding of the protein to solid supported bilayers composed of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)/ sphin¬gomyelin/cholesterol/Gb3 (40:35:20:5) or DOPC/cholesterol/Gb3 (65:30:5). The deter-mined protein height is 10 % higher than that of the crystal structure, which can be attributed to STxB-induced membrane thickening, being a result of accumulation and compaction of Gb3-molecules. The binding site III of STxB was identified to be responsible for membrane thickening, which was deduced from experiments using STxB-W34A, a protein in which binding site III was mutated. Protein clusters with a height of only 1.6 nm were observed. Labeling of lipid bilayers with fluorescent dyes enabled us to visualize the organization of coexisting liquid-disordered (ld) and liquid-ordered (lo) domains in membranes composed of DOPC/sphingomyelin/cholesterol/Gb3 (40:35:20:5) before and after protein binding. The redistribution of the fluorophore perylene from the lo into the ld phase upon protein addition was observed. Furthermore, the circularity and the surface area of the ld phase increased. From these observations, we concluded a higher lipid packing density of the lipids induced by STxB binding. Another aim of this study was to investigate the influence of fatty acids in Gb3 containing double bounds on clustering of STxB as well as the influence on lipid packing induced by protein binding. The presence of double bounds in acyl chains of Gb3 avoided dense packing of the lipids and affected lateral clustering of bound STxB. Besides the observed STxB induced lipid reorganization in solid supported bilayers, lipid monolayers at the air/water interface were used to study the organization of lipids by means of fluorescence microscopy in a more dynamic membrane system. STxB is capable of inducing a more condensed lipid phase probably enriched in Gb3. From the obtained results we conclude that STxB reorganizes lipid bilayers resulting in lipid compaction. The lipid phase is probably enriched in Gb3, which might be a prerequisite for Clathrin-independent endocytosis of STxB.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerShiga Toxinde
dc.subject.gerartifizielle Lipidmembranende
dc.subject.gerLipidphasenseparationde
dc.subject.gerRasterkraftmikroskopiede
dc.subject.gerFluoreszenzmikroskopiede
dc.subject.engShiga Toxinde
dc.subject.engartificial lipid membranesde
dc.subject.englipid phase separationde
dc.subject.engscanning force microscopyde
dc.subject.engfluorescence microscopyde
dc.subject.bk42.12 Biophysikde
dc.subject.bk35.18 Kolloidchemiede
dc.subject.bkGrenzflächenchemiede
dc.subject.bk33.68 Oberflächende
dc.subject.bkDünne Schichtende
dc.subject.bkGrenzflächende
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2166-6de
dc.identifier.purlwebdoc-2166de
dc.affiliation.instituteFakultät für Chemiede
dc.subject.gokfullSLA 500: Physik und Chemie dünner Schichtende
dc.subject.gokfullWCC 000: Molekulare Biophysik. Biophysikalische Chemiede
dc.identifier.ppn608975095de


Dateien

Thumbnail

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige