Paramagnetisch markierte Oligonukleotide

Abstract

In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur paramagnetischen Markierung von Oligonukleotiden entwickelt. Um ein paramagnetisches Zentrum in einem Biomolekül zu erhalten, muss entweder ein Metallion oder ein Radikal eingeführt werden. Dazu wurden thiol- und ethinylhaltige Oligonukleotide per Festphasensynthese dargestellt und anschließend modifiziert. Die erste Methode basiert auf einer Anbindung über eine Disulfidbrücke. Die zweite Methode basiert auf der Clickreaktion, einer Kupfer(I)-katalysierten Huisgen 1,3-dipolaren Cycloaddition. Dabei reagieren ein Azid und eine ethinylmodifizierte DNA. Die Clickreaktion an Oligonukleotiden mit 5-Ethinyl-2"-desoxyuridin erwies sich als sterisch teilweise gehindert. Durch die Verwendung des verlängerten 5-[[(4-Ethinyl)phenyl]ethinyl]-2"desoxyuridin wurde dieses Problem gelöst. Die Clickreaktion an derart modifizierten Oligonukleotiden war dabei sowohl in Lösung als auch an festphasengebundenen Oligonukleotiden möglich.Lanthanoidhaltige paramagnetische Tags sind für die NMR-Spektroskopie von großem Interesse, weil sie einerseits die Strukturberechnungen verfeinern können und andererseits auch Informationen über die Dynamik von Molekülen liefern. Dabei treten drei verschiedene Effekte in den Spektren auf: Paramagnetische Relaxationsverstärkung, Pseudokontaktverschiebungen und residuale dipolare Kopplungen. In dieser Arbeit wurde die Struktur eines 24meren DNA-Hairpins durch NMR-spektroskopische Messungen ermittelt. Dazu wurden NOE-Daten und das Strukturberechnungsprogramm CNS genutzt. An der dritten Position der DNA wurde ein paramagnetischer Tag mit Hilfe einer Clickreaktion angebracht, der anschließend mit Dysprosiumionen beladen wurde. Aus dem NOESY-Spektrum konnten dreiunddreißig Pseudokontaktshifts extrahiert werden. Das Programm Relax benutzte diese als Basis zur Berechnung des Alignmenttensors aus den Pseudokontaktshifts.