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Paramagnetisch markierte Oligonukleotide

Paramagnetically tagged oligonucleotides

by Edith Wöltjen
Doctoral thesis
Date of Examination:2009-07-01
Date of issue:2009-09-11
Advisor:Prof. Dr. Christian Griesinger
Referee:Prof. Dr. Ulf Diederichsen
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2194

 

 

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Name:woeltjen.pdf
Size:99.1Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Two methods to obtain paramagnetically tagged oligonucleotides are described. To get a biomolecule with a paramagnetic center a radical or metal moiety has to be introduced. This was done via the synthesis of thiol- and ethynylcontaining oligonucleotides produced, which could be further modified with a radical or a chelating EDTA function. The first modification method is based on the formation of a disulfide bridge. The second method uses Click Chemistry that forms a triazole ring from an ethyne and an azide via copper catalysis. As 5-ethynyl-2-deoxyuridine didn t give sufficient yields, prolonged 5-[[(4-Ethynyl)phenyl]ethynyl]-2"-deoxyuridine was used. Oligonucleotides with such a modification could be tagged in solution or on solid phase.Lanthanide containing molecules are used in NMR spectroscopy to refine NMR structures via the use of dipolar couplings, pseudocontact shifts or paramagnetic relaxation enhancement. Furthermore these tags provide additional information about the dynamics of molecules. The structure of an oligonucleotide hairpin with 24 bases is solved via NOE measurements and a CNS structure calculation. Based on this structure the paramagnetic alignment tensor of the dysprosium(III)-tagged DNA hairpin is calculated by analysis of 33 pseudocontactshifts.
Keywords: NMR; DNA; paramagnetic; oligonucleotide; lanthanide; EDTA; modification; Click reaction; pseudocontact shift

Other Languages

In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur paramagnetischen Markierung von Oligonukleotiden entwickelt. Um ein paramagnetisches Zentrum in einem Biomolekül zu erhalten, muss entweder ein Metallion oder ein Radikal eingeführt werden. Dazu wurden thiol- und ethinylhaltige Oligonukleotide per Festphasensynthese dargestellt und anschließend modifiziert. Die erste Methode basiert auf einer Anbindung über eine Disulfidbrücke. Die zweite Methode basiert auf der Clickreaktion, einer Kupfer(I)-katalysierten Huisgen 1,3-dipolaren Cycloaddition. Dabei reagieren ein Azid und eine ethinylmodifizierte DNA. Die Clickreaktion an Oligonukleotiden mit 5-Ethinyl-2"-desoxyuridin erwies sich als sterisch teilweise gehindert. Durch die Verwendung des verlängerten 5-[[(4-Ethinyl)phenyl]ethinyl]-2"desoxyuridin wurde dieses Problem gelöst. Die Clickreaktion an derart modifizierten Oligonukleotiden war dabei sowohl in Lösung als auch an festphasengebundenen Oligonukleotiden möglich.Lanthanoidhaltige paramagnetische Tags sind für die NMR-Spektroskopie von großem Interesse, weil sie einerseits die Strukturberechnungen verfeinern können und andererseits auch Informationen über die Dynamik von Molekülen liefern. Dabei treten drei verschiedene Effekte in den Spektren auf: Paramagnetische Relaxationsverstärkung, Pseudokontaktverschiebungen und residuale dipolare Kopplungen. In dieser Arbeit wurde die Struktur eines 24meren DNA-Hairpins durch NMR-spektroskopische Messungen ermittelt. Dazu wurden NOE-Daten und das Strukturberechnungsprogramm CNS genutzt. An der dritten Position der DNA wurde ein paramagnetischer Tag mit Hilfe einer Clickreaktion angebracht, der anschließend mit Dysprosiumionen beladen wurde. Aus dem NOESY-Spektrum konnten dreiunddreißig Pseudokontaktshifts extrahiert werden. Das Programm Relax benutzte diese als Basis zur Berechnung des Alignmenttensors aus den Pseudokontaktshifts.
Schlagwörter: NMR; DNA; Paramagnetisch; Oligonukleotid; EDTA; Lanthanoide; Modifizierung; Click Reaktion; Pseudokontaktverschiebung
 

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