Polymer embedding for ultrathin slicing and optical nanoscopy of thick fluorescent samples

Abstract

In den modernen Lebenswissenschaften wird häufig auf optische Fernfeldmethoden zurückgegriffen, insbesondere weil hierfür diverse spezifische Markierungstechniken zur Verfügung stehen. Dies wurde vor allem durch die Entwicklung von beugungs-unbegrenzten Techniken in den letzten zwei Jahrzehnten, allenvoran der STimulated Emission Depletion Nanoskopie (STED), forciert. Die laterale Auflösungserhöhung bereitete den Weg für eine völlig neue Ära an biologischen Fragestellungen. Die Suche nach einer erhöhten Auflösung in axialer Richtung war kurze Zeit später unabdingbar. Innerhalb dieser Arbeit wird ein anwenderfreundlicher Ansatz für die durchdringende Untersuchung von beliebig dicken Proben mit nanoskopischer Auflösung in drei Dimensionen präsentiert. STED Nanoskopie wird für die Untersuchung von 50-100nm dünnen, mechanisch angefertigten Ultradünnschnitten angewandt. Dieser Ansatz ist sehr vorteilhaft, nicht nur, weil Ultradünnschnitte eine, verglichen mit dem konfokalen Fokus, um ein Zehnfaches erhöhte axiale Auflösung ermöglichen. Besonders hervorzuheben ist die Reduktion des Fluoreszenzhintergrundes aus angrenzenden Ebenen der Probe. Darüber hinaus können einzelne Schichten der Probe unabhängig voneinander mit hoher Auflösung untersucht werden. Somit werden Photobleichen in der fokalen Umgebung, sowie Streuungs- und Abberrationseffekte in der Probe, ausgeschlossen. Zusammenfassend ist die nanoskopische Untersuchung in drei Dimensionen nicht mehr auf aufwendige Experimente, einschliesslich komplizierter experimenteller Aufbauten und computergestützter Datenanalysen, angeweisen. Noch entscheidender ist aber die Möglichkeit, beliebig dicke Proben, wie z. B. ganze Gewebeblöcke, zu untersuchen.