Ein neuer Syntheseweg für wertvolle Fettsäuren in Saccharomyces cerevisiae und Arabidopsis thaliana

Abstract

Die Erzeugung ernährungsrelevanter VLCPUFAs in transgenen Ölsaaten stellt eine bedeutende Herausforderung für die pflanzliche Biotechnologie dar. Die VLCPUFA Akkumulation in Pflanzen wurde in bisherigen Ansätzen durch die Umesterung von VLCPUFA-Vorstufen zwischen an CoA gebundenen und lipidgebundenen Formen beschränkt. Dieser ineffiziente Transportprozess hatte in früheren Arbeiten zur Akkumulation von Δ6-desaturierten Fettsäuren geführt, die für weitere Syntheseschritte dann nicht mehr zur Verfügung standen. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Engpass der VLCPUFA-Biosynthese zu umgehen und einen ausschließlich von CoA abhängigen VLCPUFA-Biosyntheseweg zu testen. Neue Gene für CoA-spezifische Δ6- und Δ5-Desaturasen wurden aus den Mikroalgen Mantoniella squamata und Ostreococcus tauri isoliert und die rekombinanten Enzyme durch heterologe Expression in Hefe charakterisiert. Eine neue Δ6-Desaturase aus M. squamata zeigte ausgeprägte Spezifität für die Umsetzung von ω3-Substraten, was beim einleitenden Schritt der Reaktionsfolge die VLCPUFA-Synthese in Richtung von ω3- anstatt weniger erwünschter ω6-Produkte lenken kann. Die weiteren neuen Δ5-Desaturasen aus M. squamata und O. tauri zeigten nur geringe Aktivität. Die neuen Acyl-CoA-abhängigen Δ6- und Δ5-Desaturasen wurden in Kombination mit der bekannten Elongase PSE1 aus Physcomitrella patens eingesetzt, um einen ausschließlich im CoA-Pool agierenden Biosyntheseweg für EPA in Arabidopsis-Samen zu etablieren. Die systematische Analyse der transgenen Samen auf den Gehalt an EPA und relevanten Zwischenprodukten zeigte, daß der limitierende Umesterungsschritt durch die von CoA abhängige Biosynthese erfolgreich umgangen werden konnte. Eine wichtige Beobachtung war, daß von Acyl-CoA abhängig synthetisierte VLCPUFAs effizienter in Speicherlipide eingebaut wurden als solche, die in Kontrollpflanzen über einen alternativen, lipidabhängigen Biosyntheseweg produziert wurden. Eine weitere Möglichkeit, die VLCPUFA-Biosynthese in Pflanzen zu optimieren, stellt der Einsatz bifunktionaler Enzyme dar. Anhand des Vergleiches einer bifunktionalen Δ12/ω3-Desaturase mit einer verwandten, strikt monofunktionalen Δ12-Desaturase wurden die Sequenzdeterminanten untersucht, die für Bifunktionalität von Desaturasen verantwortlich sind. Durch systematischen Domänenaustausch zwischen den beiden Enzymen wurde ein kurzer Sequenzabschnitt identifiziert, der hinreichende Determinanten für Bifunktionalität enthält und als membranperipherer Bereich nahe dem katalytischen Zentrum der Desaturase liegt.