Expression and Functional Analysis of Vsig1 Gene

Abstract

Das Ziel dieser Studie war das Expressionsmuster und die subzelluläre Lokalisation von VSIG1, einem Mitglied der der Immunoglobulin-Superfamilie, zu ermitteln und die Funktion des Vsig Gens zu bestimmen. Mit Hilfe des PCR-Select cDNA Subtraction Kits konnte ein cDNA Fragment (Vsig1) isoliert werden, welches hauptsächlich im Magen exprimiert wird. Um die Expression von VSIG1 auf Proteinebene und die subzelluläre Lokalisation zu analysieren, wurde ein polyklonaler anti-VSIG- Antikörper hergestellt. Northern und Western Blot-Analysen zeigten, dass das Vsig1 Gen spezifisch in Magen und Testis exprimiert wird. Die immunhistochemische Analyse konnte zeigen, dass VSIG1 auf der Plasmamembran von Drüsenepithelzellen des Magens lokalisiert ist und die stärkste Färbung in der basolateralen Membran der pit cells zeigt. Die Vsig1 mRNA und das Protein wurden im Plattenepithel der Kardia nicht gefunden. Die Analyse des Vsig1 Expressionsmusters während prä- und postnataler Entwicklungsstadien zeigte eine erste Expression von Vsig1 im Magen von E13.5 Embryonen. Die Vsig1-/Y↔Vsig1+/Y chimäre Maus, die durch Injektion von Vsig1-null Zellen in Blastozysten generiert wurde, zeigte einen geringen Chimärismus und transmittierte das Zielallel nicht an die Nachkommen. Immunhistochemische Analysen des Magens zweier Chimären zeigten, dass der Corpus des Magens Vsig1 defiziente Epithelzellen enthält. Dieses Vsig1 defiziente Epithel war dem Plattenepithel morphologisch ähnlich und exprimierte Cytokeratin-5/6, einen Marker für Plattenepithel. Um die embryonale Letalität der chimären Mäuse zu umgehen, wurden Vsig1flox/Y↔Vsig1+/Y chimärische Mäuse für konditionale Knock-out Studien generiert. Dennoch zeigten alle Chimären eine geringen Chimärismus und die meisten (75%) waren infertil. Eine Untersuchung der Spermienparameter zeigte, dass die infertilen Chimären eine verringerte Anzahl an Spermatozoen in der Cauda epididymidis und eine verminderte Spermienmotilität aufwiesen. Histologische Untersuchungen an Testis-Schnitten infertiler Chimären zeigten eine vollständige Degeneration samenbildendender Zellen in den meisten Tubuli seminiferi. Die Tubuli enthielten außerdem viele Vakuolen und im Lumen gehäuft aggregierte Zellen., aber keine Keimzellen mehr. Außerdem wurden Vsig1-EGFP transgene Mäuse generiert, die EGFP unter Kontrolle der 5`-Region des Vsig1 Gens exprimieren. Immunohistologische Untersuchungen an Mägen adulter Tiere zeigten, dass die wenigen EGFP-positiven Zellen in ungefähr jeder zwanzigsten Drüseneinheit gesammelt auftreten. Mit Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass der Anteil an EGFP-positiven Zellen in Magenzellsuspensionen während der pränatalen Entwicklung steigt und ein Maximum bei E18.5 Embryonen (8,26%) hat. Nach der Geburt verringert sich der Anteil EGFP-positiver Zellen drastisch auf 0,78% in Magensuspensionen von P90 Tieren. Der Großteil der mit Hilfe von FACS sortierten EGFP positiven Zellen heftete sich nicht an Zellkulturgefäße an und die wenigen anderen verloren ihre Fluoreszenz rasch. RT-PCR-Analysen zeigten, dass die kultivierten aus Magen gewonnenen Zellen keine Pluripotenz-Marker und frühe Epithelzell-Marker exprimierten.