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Eine funktionelle Charakterisierung der frühendosomalen SNARE-Proteine

dc.contributor.advisorJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorGeumann, Ulfde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:52:29Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:49Zde
dc.date.issued2009-06-19de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD5F-7de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-342
dc.description.abstractEin Großteil des intrazellulären Transports erfolgt über das Abschnüren, den Transport und die anschließende Fusion von Vesikeln, wobei dieser letzte Schritt von SNARE-Proteinen bewerkstelligt wird. Neben deren Funktion in der Fusion wird schon seit einiger Zeit auch über eine Beteiligung an dem, der Fusion vorausgehenden Prozess des Docking, d.h. der stabilen Verknüpfung der Organellen spekuliert. Diese Frage wurde in der vorliegenden Arbeit an frühen Endosomen untersucht. Frühe Endosomen bilden ein zentrales Sortierungskompartiment, in dem die meisten Endozytoserouten zusammenlaufen und können untereinander fusionieren, was sie zu einem viel genutzten Modellsystem gemacht hat. Um den Einfluss der SNARE-Proteine auf das Docking von frühen Endosomen analysieren zu können, musste zunächst ein geeignetes Assay entwickelt werden, da sich das für das vakuoläre System bekannte Aggregationsassay als nicht geeignet herausstellte. Mit dem neuen Assay konnte gezeigt werden, dass zwar EEA1 und Rab5 wie erwartet wichtig für das Docking von frühen Endosomen sind, dass dieses aber von einer SNARE-Funktion unabhängig ist, da weder das Verhindern der SNARE-Aktivierung durch mutiertes alphaSNAP, noch die Zugabe von löslichen SNARE-Fragmenten oder gegen die SNAREs gerichteter Fab-Fragmente einen großen Einfluss auf das Docking hatte, während die Fusion signifikant inhibiert wurde. Versuche, die SNARE-Regulation über die Rekonstitution der endosomalen SNAREs in Liposomen und anschließende Fusion mit frühen Endosomen zu analysieren, haben sich als sehr schwierig herausgestellt. Das Problem lag hierbei nicht etwa darin, dass keine Fusion erzielt worden wäre, sondern im Gegenteil daran, dass selbst proteinfreie Liposomen mit Endosomen fusionierten und zwar in vergleichbarem Umfang und praktisch identischer Kinetik wie SNARE-haltige Liposomen. Durch die Vergrößerung der Liposomen (und den dadurch reduzierte Krümmungsstress) stieg die Spezifität der Reaktion etwas an, so dass Proteoliposomen doppelt so stark mit Endosomen fusionierten wie proteinfreie Liposomen. Der vielversprechendste Weg scheint jedoch ein top-down Ansatz zu sein, d.h. Endosomen zu solubilisieren, einzelne Proteine über Immundepletion aus dieser Mischung zu entfernen und aus den verbleibenden Proteinen und Lipiden ueber Detergenzentfernug Proteoliposomen mit sehr endosomenähnlicher Zusammensetzung zu erzeugen. Für das Docking und die Fusion von Endosomen ist das Zusammenwirken von zahlreichen Faktoren erforderlich, welche in der Regel in spezialisierten Membrandomänen konzentriert vorliegen. Die Regulation dieser Domänen ist jedoch noch weitgehend unklar und wurde daher im letzten Teil der vorliegenden Arbeit für SNAREs und Synaptophysin untersucht. Bisher war es aufgrund der geringen Größe von Endosomen (ungefähr 200 nm Durchmesser) sehr schwer, Aussagen über unterschiedliche endosomale Domänen zu treffen, da sie im Bereich der Auflösungsgrenze konventioneller Lichtmikroskopie liegen. Für die vorliegende Studie konnte jedoch auf die neuentwickelte STED-Mikroskopie zurückgegriffen werden, wobei das verwendete kommerziell erhältliche Gerät eine Auflösung von 70-90 nm besitzt und die endosomale Membran dadurch einer Analyse zugänglich machte. Das im zweiten Abschnitt gewonnene Wissen über die Fusion von Liposomen mit Endosomen konnte hier genutzt werden, um über diese Fusion die Lip! idzusammensetzung der Endosomen zu verändern. Allerdings führten weder erhöhte Cholesterinkonzentrationen noch die Zufuhr von PI und PIP2 zu einer Veränderung in der Zahl der Cluster, was auf eine relative Stabilität dieser hindeutet. Interessanterweise scheinen auch die als Membranorganisatoren ins Spiel gebrachten Rab-Proteine keineswegs essentiell für diese Domänen zu sein, da die Extraktion der Rab-Proteine durch GDI praktisch keinen Einfluss auf die Domänenanzahl der untersuchten Proteine hatte.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleEine funktionelle Charakterisierung der frühendosomalen SNARE-Proteinede
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedA functional characterisation of early endosomal SNARE-proteinsde
dc.contributor.refereeJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.date.examination2009-04-29de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengMost intracellular transport processes occur via budding and fusion of vesicles, where fusion is dependent on SNARE proteins. Fusion is preceded by docking, the close contact of vesicles which has been proposed to depend on SNARE proteins as well from work in C. elegans and S. Cerevesiae. As this is still heavily debated the role of SNAREs in docking was analysed for early endosomes. Early endosomes form the first compartment reached by most routes of endocytosis and can undergo homotypic fusion which has rendered them a widely used model system. A new fluorescence based assay was developed which allowed to monitor their docking and fusion in parallel. Previous suggestions of EEA1 and Rab5 as important docking factors could be confirmed whereas no influence of SNARE proteins was found. Even though SNARE-function was blocked by three different means: competitive inhibition, antibodies and block of activation, docking remained intact whereas fusion was reduced significantly. A role of SNARE-function in early endosomal docking could therefore be ruled out. A different set of experiments aimed at the analysis of SNARE-regulation by use of a minimal system, i.e. proteoliposomes containing early endosomal SNARE proteins. Even though these proteoliposomes can fuse with each other in a SNARE-specific manner, fusion of proteoliposomes with endosomes was dependent on endosomal but not on liposomal protein content, i.e. trypsinated proteoliposomes reached similar fusion rates with endosomes as control proteoliposomes. The specificity of fusion could be increased when endosomes were solubilised completely and these mixtures were used for proteoliposome formation. Immunodepletion of selected proteins from these mixtures before reconstitution might therefore be used in the future to adress their role even though the assay has to be optimised further beforehand. Fusion and docking take place at specialised regions of the plasma membrane. Therefore, it was analysed how SNARE proteins and the vesicle marker synaptophysin distribute on endosomes. Domain analysis was performed with the recently developed superresolution STED-Microscope. The high fusion rate of liposomes with endosomes could finally be used in this context as a relatively non-invasive tool to change the lipid composition of early endosomes and thereby address the role of lipids in domain formation and stability. This was feasible because fusion was not dependent on a certain lipid composition so that liposomes with high concentrations for example of phosphatidyl inositol could be used to have a large impact on the endosomal lipid composition. Nevertheless the cluster of synaptophysin remained intact and were only destroyed after treatment with beta-methyl-cyclodextrin showing that its domains are rather stable. Interesting differences were observed between the distribution of syntaxin-1 on pure lipid membranes and endosomes as it formed much more clusters on the latter.de
dc.contributor.coRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerEndosomende
dc.subject.gerDockingde
dc.subject.gerDomänende
dc.subject.gerLiposomende
dc.subject.gerSNAREde
dc.subject.engendosomesde
dc.subject.engdockingde
dc.subject.engdomainsde
dc.subject.engliposomesde
dc.subject.engSNAREde
dc.subject.bk42.15de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2142-3de
dc.identifier.purlwebdoc-2142de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWH 000: Cytologie {Biologie}de
dc.identifier.ppn617782105de


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