Nuclear import of histone fold motif containing heterodimers by importin 13

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der nukleäre Import von zwei verwandten histone-fold Proteinpaaren, CHRAC-15/17 und p12/CHRAC-17, untersucht. Der CHRAC-15/17 Heterodimer ist dabei Bestandteil des so genannten chromatin accessibility complex (CHRAC), der sich aus SNF2H, der regulatorischen Untereinheit ACF1 und dem oben genannten CHRAC-15/17 Komplex zusammensetzt. CHRAC ist einer von fünf unterschiedlichen SNF2H Chromatin Remodeling Komplexen, die mittels ATP die Anordnung von Nukleosomen auf der DNA verändern können. Der p12/CHRAC-17 Dimer wurde hingegen als integraler Bestandteil der DNA-Polymerase ɛ identifiziert, die sich neben p12/CHRAC-17 aus einer 261 kDa großen katalytischen Untereinheit (p261) und einer weitern 59 kDa großen Untereinheit (p59) zusammensetzt. Die Polymerase ɛ ist beim Menschen verantwortlich für DNA-Reparaturen, die DNA-Replikation und des weitern für die Kontrolle des Zell-Zyklus. Die Heterodimerisierung von CHRAC-15/17 und p12/CHRAC-17 wird durch ein, in jeweils beiden Untereinheiten, evolutionär konserviertes Strukturelement, dem sogenannten histone fold motif (HFM) bewerkstelligt. In dieser Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass die beiden Heterodimere aus der Familie der H2A/H2B-Komplexe signal- und energieabhängig über einen Importin 13 vermittelten Weg in den Zellkern importiert werden. Da die monomeren Untereinheiten CHRAC-15, CHRAC-17 und p12 nicht über ein funktionelles NLS verfügen, ist der nukleäre Transport abhängig von der Heterodimerisierung der jeweiligen HFM-Untereinheiten. Demzufolge interagiert Importin 13 spezifisch mit den dimerisierten histone fold Komplexen, während die monomeren Untereinheiten weder an Importin 13 binden noch von Importin 13 in den Zellkern transportiert werden. Mutationsanalysen in CHRAC-15/17, p12/CHRAC-17 sowie dem verwandten NC2α/NC2β Komplex, konnten ferner zeigen, dass basische Aminosäuren, die innerhalb der histone fold Untereinheiten konserviert sind, für einen effektiven nukleäen Import unerlässlich sind. Die schrittweise Substitution von basischen Aminosäuren führt demzufolge zu einer kontinuierlichen Abschwächung der Importin 13 Bindung sowie der nukleären Akkumulation aller drei histone fold Heterodimere. Die Konservierung von basischen Aminosäuren innerhalb der unterschiedlichen histone fold Proteine könnte darauf hindeuten, dass durch die Dimerisierung eine Importin 13-spezifische Bindungs-Plattform gebildet wird. Da diese Bindungs-Plattform positiv geladenen Aminosäuren beinhaltet, ist davon auszugehen, dass die Interaktion zwischen den histone fold Komplexen und Importin 13 auf elektrostatischen Wechselwirkungen basiert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der in vivo Transport von CHRAC-15/17 durch die Deletion einer HEAT-Domäne am Amino-Terminus bzw. von vier HEAT-Domänen am Carboxy-Terminus in Importin 13 bereits negativ beeinflusst wird. Diese Resultate weisen auf eine große Interaktionsfläche zwischen dem nukleären Transportfaktor Importin 13 und dem histone-fold Proteinpaar hin. Ferner konnte gezeigt werden, dass der p12/CHRAC-17 Komplex abhängig vom Zellzyklus aus dem Zellkern exportiert wird. Während der Komplex in der späten G1-Phase und in der S-Phase im Zellkern lokalisiert werden konnte, wurde der p12-CHRAC-17 Heterodimer während der G1-Phase hauptsächlich im Zytoplasma detektiert. Da im Zuge der Untersuchungen Exportin 1 als potentieller Exportfaktor für p12/CHRAC-17 ausgeschlossen werden konnte, sind demzufolge andere nukleäre Exportrezeptoren für den zellzyklusabhängigen Export des histone fold Dimers verantwortlich.